Glutamate Tăng Cường Khả Năng Kháng Khuẩn Của Tôm Bằng Cách Tăng Cường Khả Năng Miễn Dịch Tế Bào Của Tôm

Tóm tắt

Glutamate từ lâu đã được ứng dụng rộng rãi trong ngành chăn nuôi nhằm thúc đẩy tăng trưởng và cải thiện chất lượng thịt ở vật nuôi. Tuy nhiên, vai trò của hợp chất này trong nuôi trồng thủy sản, đặc biệt trên các loài giáp xác, vẫn chưa được nghiên cứu sâu. Trong nghiên cứu này, chúng tôi ghi nhận rằng glutamate trong huyết dịch có khả năng làm gia tăng tổng số tế bào máu ở tôm chỉ sau hai giờ, và tác động này bị ức chế khi đồng thời tiêm chất ức chế Grik2. Các thí nghiệm bổ sung glutamate vào khẩu phần ăn tiếp tục cho thấy việc sử dụng 0,25% glutamate giúp hàm lượng glutamate trong cơ tôm tăng đáng kể, đạt mức khoảng 7%. Bên cạnh đó, kết hợp giữa thử nghiệm cho ăn và phân tích phiên mã cho thấy tôm được bổ sung glutamate có khả năng kháng vi khuẩn Vibrio tốt hơn, nhiều khả năng nhờ sự gia tăng biểu hiện của các gen liên quan đến hệ miễn dịch. Những kết quả này cho thấy glutamate không chỉ góp phần nâng cao sức đề kháng của tôm trước tác nhân gây bệnh mà còn cải thiện chất lượng cảm quan và hương vị sản phẩm. Do đó, glutamate được xem là một phụ gia thức ăn tiềm năng trong nuôi tôm, giúp tăng cường khả năng miễn dịch đồng thời nâng cao giá trị thương phẩm.

Giới thiệu

Glutamate là một phụ gia thức ăn quan trọng, được ứng dụng rộng rãi trong chăn nuôi nhiều đối tượng như lợn và cá nhờ mang lại nhiều lợi ích đáng kể. Hoạt chất này giúp giảm stress oxy hóa, tăng sản lượng sữa ở lợn nái đang nuôi con, đồng thời thúc đẩy tăng trưởng, cải thiện khả năng chống oxy hóa, nâng cao năng suất và tăng cường sức khỏe tổng thể ở gia cầm. Tuy nhiên, dù đã được nghiên cứu và sử dụng phổ biến trên nhiều vật nuôi, cơ chế tác động của glutamate ở động vật giáp xác vẫn chưa được làm rõ. Khoảng trống kiến thức này đang trở thành rào cản đối với việc mở rộng và tối ưu ứng dụng glutamate trong nuôi trồng thủy sản giáp xác.

Glutamate không chỉ đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp thức ăn chăn nuôi mà còn được ứng dụng rộng rãi trong y học như một chất dinh dưỡng cho hệ thần kinh. Các thụ thể của glutamate, vốn được bảo tồn cao ở các loài động vật đa bào, được chia thành hai nhóm chính: thụ thể glutamate ionotropic (iGluRs) và thụ thể glutamate metabotropic (mGluRs). Những thụ thể này phân bố ở nhiều cơ quan khác nhau, bao gồm cả hệ thần kinh trung ương (CNS) và hệ nội tiết, ở cả động vật có xương sống và không xương sống. Các nghiên cứu gần đây cho thấy thụ thể glutamate (GluR) cũng được biểu hiện trên một số loại tế bào miễn dịch đặc hiệu, chẳng hạn như tế bào ức chế có nguồn gốc từ tủy (MDSC) và tế bào T.

Các loài Vibrio được xác định là những tác nhân gây bệnh chủ yếu trong ngành nuôi tôm, đóng vai trò quan trọng trong các đợt bùng phát dịch nghiêm trọng như Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) và Hội chứng chết sớm (EMS). Tôm chống lại sự xâm nhập của Vibrio thông qua hệ thống miễn dịch, bao gồm cả yếu tố dịch thể và tế bào. Vì vậy, việc gia tăng tổng số lượng tế bào máu (THC) ở tôm được xem là một chiến lược tiềm năng nhằm nâng cao khả năng miễn dịch chống lại Vibrio.

Trong nghiên cứu trước, chúng tôi đã phát hiện rằng Grik2, một thụ thể glutamate ionotropic có tính bảo tồn cao được biểu hiện một cách chuyên biệt trong các tế bào tiền hồng cầu của tôm. Phát hiện này gợi ý rằng glutamate có thể đóng vai trò thúc đẩy phản ứng miễn dịch ở tôm thông qua Grik2 hiện diện trong các tế bào máu. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi tiến hành khảo sát một cách hệ thống mối liên hệ giữa glutamate và khả năng miễn dịch tế bào ở tôm, từ đó xây dựng cơ sở khoa học vững chắc cho việc ứng dụng glutamate trong ngành nuôi tôm.

Vật liệu và phương pháp

Tuyên bố về đạo đức trên động vật

Tất cả các thí nghiệm trên động vật đều được tiến hành theo các hướng dẫn đã thiết lập và được Ủy ban nghiên cứu động vật và đạo đức tại Đại học Shantou chấp thuận.

Tôm

Tôm khỏe mạnh (1–2 g) cho thí nghiệm nhân giống được cung cấp bởi Cơ sở nhân giống tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Thủy sản Quảng Tây. Tôm khỏe mạnh (5–10 g) cho các thí nghiệm sinh hóa được mua từ một trang trại nuôi cá địa phương ở Shantou. Trước khi thí nghiệm, tôm được thích nghi trong 5 ngày trong điều kiện thử nghiệm.

Chuẩn bị thức ăn

Công thức thức ăn và sản xuất được cung cấp bởi Guangdong Nutriera Group Co., Ltd. (Chu Hải, Trung Quốc). Nguyên liệu thô được cân theo Bảng 1, trộn bằng máy trộn trong 20 phút, sau đó nghiền trong máy nghiền trong hai vòng. Hỗn hợp được rây qua rây 40 mắt lưới và sau đó trộn với 10% nước. Thức ăn được tạo hạt bằng máy tạo viên trong phòng thí nghiệm (50 kg) (Số ZC-2,206,200,002, Hạ Môn, Trung Quốc) và sấy khô ở 95℃ trong 5 giờ. Thức ăn đã chuẩn bị được bảo quản ở nhiệt độ − 20℃ để sử dụng sau này. Glutamate được mua từ Shanghai Macklin Biotechnology Co., Ltd (Thượng Hải, Trung Quốc).

Mỗi kg Premix 972 cho tôm chứa các thành phần sau: Vitamin A>250000IU, Vitamin D3:55.000–166000IU, Vitamin E ≥ 4000 mg, Vitamin K3 ≥ 400 mg, Vitamin B1 ≥ 820 mg, Vitamin B2 ≥ 800 mg, Vitamin B6 ≥ 2500 mg, Vitamin B12 ≥ 6 mg, Vitamin C ≥ 12000 mg, D-Calcium Pantothenate ≥ 2500 mg, Nicotinamide ≥ 6000 mg, Axit folic ≥ 500 mg, D-Biotin ≥ 10 mg, Inositol ≥ 8000 mg, Magnesi sulfat ≥ 5000 mg, Kẽm Sunfat: 2250–12500 mg, Mangan sunfat: 650–8300 mg, Đồng sunfat: 160–2000 mg, Sắt sunfat: 4500–62500 mg, Coban sunfat: 125–160 mg, Kali iodua: 75–1600 mg, Natri selenat: 25–40 mg, Độ ẩm ≤ 10 %, Chất mang: thêm canxi cacbonat nhẹ và vỏ trấu để đạt 1 kg.

Thí nghiệm cho ăn

Tổng cộng 900 con tôm (trọng lượng ban đầu trung bình là 1,19 ± 0,07 g) được phân bố vào 15 bể có kích thước 96 cm × 80 cm × 73 cm, với 60 con tôm trong mỗi bể. Mỗi ba bể được gộp thành một nhóm, tạo thành năm nhóm khác nhau, tương ứng với các mức bổ sung glutamate trong thức ăn là 0; 0,10%; 0,25%; 0,50% và 1,00%. Thí nghiệm được tiến hành trong 35 ngày (xem Bảng 1). Tôm được cho ăn bốn lần mỗi ngày vào các khung giờ 8:00, 11:00, 15:00 và 18:00. Lượng thức ăn được điều chỉnh theo mức độ tiêu thụ của tôm, và phần thức ăn thừa cùng chất thải được thu gom sau 1,5 giờ kể từ mỗi lần cho ăn. Tôm được cho ăn đến khi no nhằm hạn chế tình trạng dư thừa thức ăn. Trong mỗi lần cho ăn, các mảnh thức ăn còn lại được loại bỏ bằng cách hút chân không, đồng thời thay mới 30% thể tích nước trong bể mỗi ngày. Các chỉ tiêu chất lượng nước được duy trì ổn định, bao gồm: độ mặn 20 ‰, nhiệt độ từ 23 đến 27℃, pH trong khoảng 7,8–8,2, nồng độ oxy hòa tan 6,8–7,0 mg/L và hàm lượng nitơ amoniac 0,3–0,4 mg/L.

Đo lường cơ thể tôm

Vào cuối thí nghiệm, tôm bị bỏ đói trong 24 giờ và sau đó cân riêng từng con để đảm bảo dữ liệu chính xác (Bảng 2). Trọng lượng cơ thể ban đầu (IBW) và trọng lượng cơ thể cuối cùng (FBW) đã được ghi lại. Các chỉ số sau đây đã được tính toán: tỷ lệ sống (SR), tỷ lệ tăng trọng (WGR), tỷ lệ tăng trưởng cụ thể (SGR), tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR), hệ số điều kiện (CF) và chỉ số gan tụy (HSI). Các công thức như sau:

SR % = 100 × (số lượng tôm cuối cùng / số lượng tôm ban đầu).

WGR % = 100 × [(trọng lượng cơ thể cuối cùng) − (trọng lượng cơ thể ban đầu)] / trọng lượng cơ thể ban đầu.

SGR (%/ngày) = 100 × ln(trọng lượng cơ thể cuối cùng / trọng lượng cơ thể ban đầu) / ngày.

FCR = thức ăn khô tiêu thụ / (trọng lượng cơ thể cuối cùng − trọng lượng cơ thể ban đầu).

CF % = 100 × (trọng lượng cơ thể cuối cùng / (chiều dài cơ thể cuối cùng)³)

HSI % = 100 × (trọng lượng gan tụy / tổng trọng lượng cơ thể).

Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± Độ lệch chuẩn (n = 3 bể), sự khác biệt về mặt thống kê được đánh giá bằng ANOVA một chiều. Các giá trị được đánh dấu bằng “a, b và c” khác biệt đáng kể theo phép thử phạm vi đa biến của Duncan.

SR: tỷ lệ sống, IBW: trọng lượng cơ thể ban đầu, FBW: trọng lượng cơ thể cuối cùng, WGR: tỷ lệ tăng trọng, SGR: tỷ lệ tăng trưởng riêng, FCR: tỷ lệ chuyển đổi thức ăn, CF: hệ số điều kiện, HIS: chỉ số gan.

Phân tích thành phần của tôm

Thành phần của thức ăn (Bảng 1) và cơ tôm (Bảng 3) được phân tích theo phương pháp AOAC. Vật chất khô được xác định bằng cách sấy ở 105℃ cho đến khi trọng lượng không đổi. Protein thô được đo bằng phương pháp Kjeldahl (Kjeltec™ 8400, FOSS), với hàm lượng nitơ nhân với 6,25. Chất béo thô được đo bằng phương pháp chiết xuất ete sử dụng máy chiết xuất Soxhlet (SZF-06A, Xinjia Instrument). Hàm lượng tro được xác định bằng cách đốt các mẫu trong lò nung (CWF1100; Carbolite) ở 550℃ trong 6 giờ. Hàm lượng axit amin trong thức ăn thử nghiệm và cơ tôm được phân tích bởi Guangdong Nutriera Group Co., Ltd. (Chu Hải, Trung Quốc) (Bảng 4, 5)

Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD. (n = 3 bể), sự khác biệt về mặt thống kê được đánh giá bằng ANOVA một chiều. Các giá trị được đánh dấu bằng “a và b” khác biệt đáng kể theo thử nghiệm phạm vi đa dạng của Duncan.

NEAA: Axit amin thiết yếu.

EAA: Axit amin không thiết yếu.

TAA: Tổng số axit amin.

Đo glutamate hemolymp tôm

NEAA: Axit amin thiết yếu.

EAA: Axit amin không thiết yếu.

Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD. (n = 3 bể), sự khác biệt về mặt thống kê được đánh giá bằng ANOVA một chiều. Các giá trị được đánh dấu bằng “a và b” khác biệt đáng kể theo thử nghiệm phạm vi đa dạng của Duncan.

Hemolymp từ mỗi con tôm được thu thập và trộn với một thể tích bằng nhau (1:1, v/v) dung dịch chống đông (140 mM NaCl, 110 mM glucose, 25,8 mM natri citrat, 32,8 mM axit citric, pH 6,0). Hỗn hợp được ly tâm ở tốc độ 800 g trong 10 phút để loại bỏ tế bào máu và phần dịch trong được gửi đến Công ty TNHH Công nghệ sinh học Qiyi Thượng Hải (Thượng Hải, Trung Quốc) để đo glutamine. Hàm lượng glutamate được đo bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng RIGOL L3000 (Quảng Châu, Trung Quốc). Nồng độ glutamate được tính như sau:

Nồng độ glutamate (μg / mL) = f1/f2 × C,

trong đó

f1: diện tích đỉnh của glutamate trong dung dịch mẫu/diện tích đỉnh chuẩn nội;

f2: diện tích đỉnh của glutamate trong dung dịch chuẩn axit amin hỗn hợp/diện tích đỉnh chuẩn nội;

C: nồng độ glutamate trong dung dịch chuẩn axit amin hỗn hợp.

Thí nghiệm tiêm

Tôm được tiêm 100 μL dung dịch chứa 10 μM glycine, 10 μM glutamine hoặc kết hợp 10 μM glutamine với 250 nM WAY-303,290 (chất ức chế Grik2; Aladdin®, Thượng Hải, Trung Quốc) đã hòa tan trong PBS, với liều lượng tương ứng cho mỗi 5 g khối lượng tôm. Mẫu tế bào máu được thu thập tại các thời điểm 0, 2, 4 và 8 giờ sau tiêm để phục vụ cho các phân tích tiếp theo.

Đo tổng số lượng tế bào máu

Thu thập hemolymp từ mỗi con tôm và trộn với một thể tích bằng nhau (1:1, v/v) dung dịch chống đông. Đếm tế bào máu được thực hiện bằng máy đếm tế bào máu (Qiujing, Thượng Hải, Trung Quốc).

Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn Vibrio

Chủng vi khuẩn gây bệnh Vibrio parahaemolyticus được cung cấp bởi Viện Hàn lâm Khoa học Thủy sản Quảng Tây. Vi khuẩn được nuôi qua đêm trong môi trường LB ở 37°C, sau đó cấy chuyển sang 50 mL môi trường LB tươi và tiếp tục nuôi trong 4 giờ. Các tế bào vi khuẩn được thu bằng cách ly tâm ở 10.000 g trong 10 phút, sau đó rửa bằng dung dịch PBS và được huyền phù lại. Từ mỗi nhóm tôm được cho ăn, 40 cá thể được chọn ngẫu nhiên để tiêm huyền phù V. parahaemolyticus với liều lượng 5 × 10⁵ CFU/g. Tỷ lệ sống của tôm được ghi nhận định kỳ mỗi 6 giờ trong vòng 120 giờ sau khi tiêm.

Phân tích phiên mã

Vào cuối thí nghiệm, các mẫu tế bào máu được thu thập từ 12 con tôm được chọn ngẫu nhiên trong mỗi nhóm. Sau đó, các tế bào này được ly tâm ở 900 g trong 3 phút để tách chiết RNA tổng số, và RNA thu được được gửi đến Công ty Genedenovo (Quảng Châu, Trung Quốc) để thực hiện giải trình tự phiên mã. Dữ liệu giải trình tự sau khi được lắp ráp đã được nộp lên GenBank với số hiệu truy cập PRJNA1085979. Phân tích các gen có biểu hiện khác biệt (DEG) được thực hiện theo phương pháp đã công bố trước đó. Các DEG được xác định là những gen có giá trị FDR ≤ 0,05 và tỷ lệ biểu hiện TPM (số bản sao trên một triệu lượt đọc) lớn hơn 2.

Chuẩn bị cDNA và PCR định lượng thời gian thực (qPCR)

Trong thí nghiệm tiêm, các tế bào máu từ mỗi mười con tôm được xử lý theo cùng một phương pháp được gộp lại thành một mẫu duy nhất để tiến hành chuẩn bị cDNA. Đối với thí nghiệm cho ăn, 15 con tôm được chọn ngẫu nhiên từ mỗi nhóm sau 35 ngày cho ăn, sau đó các tế bào máu từ mỗi năm con tôm được gộp lại để tạo thành một mẫu duy nhất. Tổng RNA được tách chiết bằng bộ kit RNAfast200 (FeiJie, Thượng Hải, Trung Quốc). Các mẫu tế bào máu được ly tâm ở 800 g trong 10 phút, giữ lại khoảng 150 μL phần dịch nổi. Phần dịch còn lại được lắc đều cho đến khi không còn thấy cục tế bào. Tiếp đó, 100 μL hỗn hợp này được chuyển vào ống Eppendorf, trộn với 500 μL dung dịch đệm RA2 và lắc nhẹ trong 1 phút. Hỗn hợp phân hủy sau đó được chuyển vào cột RNAfast200 và ly tâm ở tốc độ 10.000 g trong 1 phút. Dịch chảy qua bị loại bỏ, và cột được rửa hai lần bằng 500 μL dung dịch rửa, mỗi lần đều ly tâm trong 1 phút. Một lần quay khô bổ sung được thực hiện để loại bỏ hết ethanol còn sót lại. RNA được rửa giải bằng cách thêm 25 μL dung dịch rửa giải trực tiếp vào màng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút trước khi ly tâm trong 1 phút. Để loại bỏ DNA bộ gen bị nhiễm, sử dụng bộ phản ứng PrimeScript™ RT với gDNA Eraser (TaKaRa, Nhật Bản). Sau đó, quá trình phiên mã ngược được tiến hành để tổng hợp cDNA, phục vụ cho phản ứng qPCR bằng các cặp mồi được liệt kê trong Bảng 6. Biểu hiện tương đối của các gen mục tiêu được tính toán theo phương pháp 2^-ΔΔCT, với Lv-EF1α được sử dụng làm đối chứng nội tại. Mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần độc lập.

Phân tích thống kê

Dữ liệu tăng trưởng thực nghiệm, bao gồm thành phần thức ăn/cơ, thành phần axit amin và biểu hiện gen tương đối, được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (trung bình ± SD). Phần mềm SPSS 27.0.1 (SPSS Inc., Michigan Avenue, Chicago, IL, Hoa Kỳ) được sử dụng để thực hiện phân tích ANOVA một chiều và so sánh bội số Duncan nhằm xác định sự khác biệt có ý nghĩa, với giá trị p < 0,05 chỉ ra sự khác biệt đáng kể. Dữ liệu tỷ lệ sống sót được phân tích bằng kiểm định log-rank (Mantel_Cox). Đối với thí nghiệm tiêm, kiểm định Student t-test hai đuôi không ghép đôi được áp dụng để phân tích dữ liệu.

Kết quả

Mối tương quan giữa mức glutamate hemolymp của tôm và tổng số tế bào máu của nó

Nồng độ glutamate hemolymp trong tôm lấy mẫu dao động từ 8 đến 17 mM, trong khi giá trị THC thay đổi từ 0,8 × 10⁷ tế bào / ml đến 3,6 × 10⁷ tế bào / ml (Hình 1). Phân tích hồi quy tuyến tính về mối quan hệ giữa nồng độ glutamate hemolymp và THC đã chứng minh mối tương quan tích cực giữa hai biến này.

Cải thiện hiệu suất tăng trưởng, hương vị và tổng số tế bào máu của tôm nhờ vào sự kích hoạt GRIK2 do glutamate tác động

Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, so với glycine, việc tiêm glutamate làm tăng đáng kể mức THC sau 2 giờ tiêm. Hơn nữa, việc sử dụng đồng thời WAY-303,290 đã làm giảm hiệu quả gia tăng này (Hình 2A). Thêm vào đó, tiêm glutamate đã làm tăng sự điều hòa một số gen liên quan đến chu kỳ tế bào và con đường truyền tín hiệu Hippo, trong khi sự biểu hiện của các gen này bị ức chế khi có mặt của WAY-303,290 (Hình 2B). Cụ thể, các gen bị ảnh hưởng bao gồm: Sphase kinase-associated protein 2-like (ncbi_113,826,388), đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa sự tiến triển chu kỳ tế bào thông qua việc phân hủy các protein bằng cách nhắm mục tiêu vào các phân tử qua trung gian ubiquitin, đặc biệt trong pha S. Protein phosphatase đặc hiệu kép giống 7 (ncbi_113,827,639), có liên quan đến quá trình khử phosphoryl hóa các gốc tyrosine và serine/threonine, góp phần vào điều hòa chu kỳ tế bào và các con đường truyền tín hiệu, giúp duy trì cân bằng nội môi tế bào. Cyclin-E giống G1/S đặc hiệu (ncbi_113,822,658), cần thiết cho sự chuyển đổi từ pha G1 sang pha S, thúc đẩy tiến trình chu kỳ tế bào thông qua việc kích hoạt các kinase phụ thuộc cyclin (CDK), đóng vai trò quan trọng trong quá trình sao chép DNA. Các gen liên quan đến con đường truyền tín hiệu Hippo, chẳng hạn như yếu tố tăng cường phiên mã giống TEF-1 (ncbi_113,823,667), cũng được phát hiện là gia tăng sau khi tiêm glutamate, trong khi sự biểu hiện của chúng bị ức chế khi có sự hiện diện của WAY-303,290 (Hình 2B).

Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu khả năng ứng dụng của glutamate trong nuôi tôm. Cụ thể, chúng tôi đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung glutamate đến hiệu suất tăng trưởng và thành phần cơ của tôm. Kết quả cho thấy phần lớn các chỉ tiêu liên quan đến tăng trưởng không có sự khác biệt rõ rệt giữa các mức bổ sung glutamate khác nhau, ngoại trừ histidine (HIS) tăng lên khi bổ sung glutamate (Bảng 2). Phân tích thành phần cơ cho thấy tỷ lệ protein thô tăng đáng kể khi hàm lượng glutamate bổ sung vượt quá 0,25% (Bảng 3). Đặc biệt, nồng độ glutamate trong cơ tôm cũng tăng lên rõ rệt khi mức bổ sung đạt từ 0,25% trở lên (Bảng 5). Những phát hiện này gợi ý rằng glutamate không chỉ có khả năng ảnh hưởng đến hoạt động của tế bào máu thông qua kích hoạt Grik2, mà còn tác động tích cực đến thành phần cơ, đặc biệt là hàm lượng protein và histidine.

Tác dụng chống Vibrio khi bổ sung glutamate

Tế bào máu đóng vai trò thiết yếu trong cơ chế bảo vệ tự nhiên của tôm trước sự xâm nhập của các loài vi khuẩn Vibrio. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã bổ sung glutamate vào khẩu phần ăn của tôm với các nồng độ khác nhau (0; 0,10%; 0,25%; 0,50% và 1,00%) nhằm đánh giá ảnh hưởng của glutamate đến khả năng kháng Vibrio của tôm (Bảng 1). Việc bổ sung glutamate không làm thay đổi đáng kể thành phần dinh dưỡng tổng thể của thức ăn (Bảng 1), nhưng đã làm gia tăng rõ rệt hàm lượng glutamate trong khẩu phần ăn, từ 7,83% lên 8,72% khi bổ sung 1,00% glutamate (Bảng 4). Sau 35 ngày cho ăn, tổng số lượng tế bào máu (THC) được đo lường. Kết quả cho thấy THC tăng đáng kể ở các nhóm được bổ sung 0,10% và 0,25% glutamate, trong khi hiệu quả này giảm dần ở các mức bổ sung cao hơn như 0,50% và 1,00% (Hình 3A). Đặc biệt, trong các thí nghiệm cảm nhiễm với Vibrio, chỉ nhóm tôm được bổ sung 0,25% glutamate thể hiện khả năng kháng khuẩn vượt trội có ý nghĩa thống kê (Hình 3B).

Phân tích gen biểu hiện khác biệt (DEG) của tế bào máu tôm với khẩu phần ăn bổ sung glutamate khác nhau

Nhằm làm rõ hơn các kiểu hình phức tạp của tôm liên quan đến việc bổ sung glutamate, các tế bào máu đã được thu thập từ tôm tiếp xúc với các nồng độ glutamate khác nhau và phân tích thông qua hồ sơ phiên mã. So với nhóm đối chứng (0% glutamate), kết quả cho thấy sự thay đổi rõ rệt trong biểu hiện gen: ở nhóm 0,10% glutamate, có 615 gen được điều chỉnh tăng và 410 gen điều chỉnh giảm; nhóm 0,25% ghi nhận 953 gen tăng và 524 gen giảm; nhóm 0,50% có 763 gen tăng và 369 gen giảm; trong khi nhóm 1,00% ghi nhận 830 gen tăng và 435 gen giảm (Hình 4A). Phân tích sâu hơn dựa trên cơ sở dữ liệu KEGG (Bách khoa toàn thư về gen và bộ gen Kyoto) cho thấy: ở nhóm 0,25%, các gen liên quan đến con đường truyền tín hiệu Hippo được làm giàu đáng kể, với RichFactor vượt 0,2. Nhóm 0,50% cho thấy sự làm giàu rõ rệt các gen tham gia vào quá trình chuyển hóa d-glutamine và d-glutamate, với RichFactor vượt ngưỡng 0,4. Đối với nhóm 1,00%, các gen liên quan đến sửa chữa không khớp và chuyển hóa d-arginine và d-ornithine cũng được làm giàu đáng kể, với RichFactor trên 0,25 (Hình 4B). Để hiểu rõ hơn các kiểu hình quan sát được, chúng tôi đã xác định và xác nhận các gen có mức biểu hiện cao nhất trong nhóm 0,25%, bao gồm: lectin loại C 2 (ncbi_113816183), cyclin-E đặc hiệu G1/S (ncbi_113822658), yếu tố tăng cường phiên mã giống TEF-1 (ncbi_113823667) và protein giống miền liên kết ras 4 (ncbi_113821473) (Hình 5 và Hình 6).

Thảo luận

Glutamate, một axit amin đa chức năng, đã được sử dụng phổ biến trong ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi. Nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra rằng tôm có phản ứng nhạy hơn với glutamate so với các loài vật nuôi khác. Khi được bổ sung glutamate với tỷ lệ phù hợp vào khẩu phần ăn, tôm thể hiện khả năng đề kháng cao hơn với các loài vi khuẩn Vibrio và chất lượng hương vị cũng được cải thiện. Tuy nhiên, việc sử dụng glutamate ở nồng độ quá cao có thể gây ra những ảnh hưởng tiêu cực, làm giảm hiệu quả tích cực ban đầu.

Phát hiện của chúng tôi cho thấy việc bổ sung glutamate trong nuôi tôm mang lại những hiệu quả tương tự như khi áp dụng trong nuôi cá. Cụ thể, glutamate đã được chứng minh là có thể cải thiện rõ rệt hệ số tình trạng và chỉ số nội tạng của cá trắm cỏ non (Ctenopharyngodon idella). Ngoài ra, các nghiên cứu cho thấy việc bổ sung từ 1–4% glutamate vào khẩu phần ăn giúp nâng cao hiệu suất tăng trưởng, chất lượng phi lê, khả năng chống oxy hóa, chức năng tiêu hóa và hấp thụ, cũng như tăng cường phản ứng miễn dịch ở nhiều loài cá. Trong nghiên cứu với tôm, chúng tôi ghi nhận những cải thiện tương tự về sức đề kháng và chất lượng phi lê ngay cả khi sử dụng liều lượng thấp hơn (0,25%). Điều này gợi ý rằng mặc dù hiệu quả mang lại tương đương, tôm có ngưỡng chịu đựng glutamate thấp hơn đáng kể so với cá.

Việc bổ sung glutamate vào khẩu phần ăn với mức từ 0,50% trở lên có vẻ vượt quá khả năng chuyển hóa của tôm, gây ra tổn thương DNA. Điều này được thể hiện qua sự kích hoạt của các gen liên quan đến dị hóa glutamate và sửa chữa DNA khi tôm được cho ăn khẩu phần chứa 0,50% và 1,00% glutamate (Hình 4). Hàm lượng glutamate cao không chỉ gây độc tính thần kinh và liên quan đến các quá trình thoái hóa thần kinh ở người, mà còn làm tăng stress oxy hóa ở các loài chân khớp như Nauphoeta cinerea. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy rằng việc bổ sung glutamate quá mức có thể làm giảm tỷ lệ sống sót ở các loài giáp xác, có khả năng thông qua các cơ chế tương tự như ở động vật có xương sống và côn trùng.

Con đường truyền tín hiệu Hippo là một cơ chế sinh học được bảo tồn qua quá trình tiến hóa, tham gia điều hòa nhiều hoạt động quan trọng của tế bào. Trong đó, TEF-1 – thành viên thuộc họ yếu tố phiên mã TEAD – đóng vai trò trung tâm trong việc kiểm soát biểu hiện gen của con đường này. Khi tín hiệu Hippo bị ức chế, TEF-1 sẽ kết hợp với YAP/TAZ ở trạng thái chưa phosphoryl hóa để thúc đẩy biểu hiện các gen liên quan đến tăng sinh và duy trì sự sống của tế bào. Điều này có thể giải thích vì sao nhóm tôm được bổ sung 0,25% glutamate ghi nhận mức biểu hiện TEF-1 cao nhất, đồng thời sở hữu số lượng tế bào máu toàn phần (THC) vượt trội. Một số nghiên cứu gần đây cũng cho thấy con đường Hippo có liên quan đến khả năng kháng vi khuẩn Vibrio ở tôm theo hướng điều hòa tiêu cực. Vì vậy, việc bổ sung glutamate ở mức thích hợp có thể giúp tối ưu hóa hoạt động của con đường này, qua đó tăng cường đáp ứng miễn dịch và hỗ trợ quá trình tăng sinh tế bào. Ở nhóm bổ sung 0,5% glutamate, các gen liên quan đến chuyển hóa d-glutamine và d-glutamate được làm giàu rõ rệt, cho thấy mối liên hệ chặt chẽ giữa các con đường chuyển hóa này với chức năng miễn dịch. Trong điều kiện nhiễm bệnh và stress, quá trình dị hóa trong cơ thể gia tăng khiến các tế bào miễn dịch tiêu thụ glutamine với tốc độ cao để tạo ra các chất chuyển hóa quan trọng như glutamate, aspartate và alanine. Những hợp chất này đóng vai trò cung cấp năng lượng cũng như nguyên liệu cần thiết cho hoạt động của tế bào miễn dịch. Do đó, mức bổ sung 0,5% glutamate có thể đã vượt quá nhu cầu sử dụng sinh lý bình thường của tôm, dẫn đến hiện tượng dị hóa chưa hoàn toàn và làm tăng biểu hiện của các gen liên quan đến chuyển hóa.

Trong nhóm sử dụng 1% glutamate, một số dấu hiệu độc tính tế bào đã được ghi nhận, có liên quan đến sự tăng cường biểu hiện các gen liên quan đến sửa chữa sai khớp cũng như quá trình chuyển hóa d-arginine và d-ornithine. Sự gia tăng điều hòa này có thể phản ánh sự kích hoạt của các phản ứng miễn dịch và viêm, do các quá trình chuyển hóa này đóng vai trò cung cấp năng lượng và chất nền cần thiết cho hoạt động của tế bào miễn dịch. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi củng cố nhận định này, khi cho thấy tôm được bổ sung 0,25% glutamate có mức hoạt động của con đường Hippo thấp nhất, đồng thời thể hiện phản ứng miễn dịch mạnh mẽ nhất trước sự xâm nhiễm của Vibrio.

Các kết quả nghiên cứu hiện nay cho thấy glutamate được điều hòa chặt chẽ trong cơ thể tôm và giữ vai trò quan trọng đối với quá trình sinh trưởng, phát triển. Cơ chế kiểm soát này nằm trong một mạng lưới sinh học phức tạp mà đến nay chúng ta mới chỉ hiểu được một phần nhỏ. Bên cạnh đó, nguồn protein cao trong khẩu phần ăn của tôm cũng có thể được chuyển hóa thành glutamate tại đường ruột, từ đó đặt ra vấn đề về sự khác biệt trong tác động sinh học giữa glutamate hình thành từ quá trình chuyển hóa protein và glutamate bổ sung ở dạng tinh thể. Vì vậy, các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung làm rõ sự khác biệt này cũng như đánh giá ảnh hưởng của từng nguồn glutamate đối với tăng trưởng và sức khỏe của tôm.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành đánh giá toàn diện tác động của glutamate dạng tinh thể khi bổ sung vào thức ăn cho tôm. Những kết quả thu được đã cung cấp cơ sở khoa học đáng tin cậy cho việc ứng dụng glutamate dạng tinh thể như một phụ gia dinh dưỡng trong khẩu phần ăn, góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất thức ăn cho ngành nuôi giáp xác.

Kết luận

Tóm lại, nghiên cứu này đã mang đến cái nhìn toàn diện về ảnh hưởng của việc bổ sung glutamate tinh thể vào khẩu phần ăn của tôm. Kết quả cho thấy, mức bổ sung 0,25% glutamate giúp tăng cường đáng kể khả năng kháng Vibrio đồng thời cải thiện chất lượng hương vị. Tuy nhiên, khi hàm lượng vượt quá ngưỡng này, hiệu quả tích cực có xu hướng suy giảm. Đáng chú ý, nghiên cứu cũng xác định con đường truyền tín hiệu Hippo đóng vai trò trung tâm trong việc điều hòa phản ứng miễn dịch liên quan đến glutamate. Những phát hiện này mở ra cơ sở khoa học quan trọng cho việc ứng dụng glutamate như một phụ gia dinh dưỡng trong ngành thức ăn thủy sản dành cho động vật giáp xác, đồng thời cho thấy cần có thêm nhiều nghiên cứu chuyên sâu để làm sáng tỏ các cơ chế sinh học phức tạp liên quan.

Theo Lei Ma, Wenyong Jiang, Zhiyao Lu, Yanmei Tong, Qingyun Liu, Zhonghua He, Xiuli Chen, Yongzhen Zhao, Fan Wang

Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2950311625000102

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Bình Minh Capital

Xem thêm:

• Ứng dụng chỉ số phúc lợi chung cho tôm thẻ chân trắng trong quá trình nuôi ao
• Phân Tích Phiên Mã mRNA và RNA Vòng Cho Thấy Việc Bổ Sung Lactiplantibacillus Plantarum Đông Khô Vào Khẩu Phần Ăn Giúp Tăng Cường Trí Nhớ Miễn Dịch Của Tôm Thẻ Chân Trắng (Penaeus vannamei) Chống Lại Mầm Bệnh
• Artemia, “Bột Thần Kỳ” Thúc Đẩy Một Ngành Công Nghiệp Trị Giá Hàng Tỷ Đô La