Probiotic Lactobacillus pentosus BD6 Thúc Đẩy Tăng Trưởng Và Tình Trạng Sức Khỏe Của Tôm Thẻ Chân Trắng Litopenaeus vannamei Qua Đường Miệng

Tóm tắt

Nghiên cứu này đánh giá hiệu quả của men vi sinh Lactobacillus pentosus BD6 khi được bổ sung qua đường miệng đối với hiệu suất tăng trưởng, khả năng miễn dịch và sức đề kháng của tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei. Tôm được cho ăn thức ăn chứa Lactobacillus pentosus BD6 ở các mức độ khác nhau (10⁹-10¹⁰ cfu/kg) cho thấy sự gia tăng đáng kể về hiệu suất tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn, khả năng miễn dịch và khả năng kháng bệnh chống lại Vibrio alginolyticus. Tôm được cho ăn khẩu phần ăn có chứa men vi sinh Lactobacillus pentosus BD6 ở mức 10¹⁰ cfu/ kg cho thấy tỷ lệ chết thấp hơn đáng kể sau khi cảm nhiễm với Vibrio alginolyticus. Ngoài ra, tôm được cho ăn khẩu phần ăn có chứa men vi sinh Lactobacillus pentosus BD6 ở mức 10¹⁰ cfu/ kg cũng cho thấy tiềm năng chữa bệnh, giúp giảm tỷ lệ chết tích lũy của tôm bị nhiễm Vibrio parahaemolyticus. Hệ vi sinh vật đường ruột của tôm được cải thiện với sự gia tăng vi khuẩn có lợi và giảm vi khuẩn gây bệnh. Kết luận là Lactobacillus pentosus BD6 là một chế phẩm sinh học tiềm năng có thể được sử dụng để cải thiện hiệu suất tăng trưởng, khả năng miễn dịch và khả năng kháng bệnh của tôm thẻ chân trắng.

1. Giới thiệu

Nuôi trồng thủy sản đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp nguồn thực phẩm thủy sản, nhưng ngành này đang phải đối mặt với nhiều thách thức, đặc biệt là vấn đề dịch bệnh. Việc sử dụng chế phẩm sinh học, bao gồm vi khuẩn axit lactic (LAB), là một giải pháp tiềm năng và thân thiện với môi trường để phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản. LAB có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh phổ biến trong nuôi trồng thủy sản như Vibrio, giúp bảo vệ sức khỏe vật nuôi. Ngoài việc ức chế mầm bệnh, chế phẩm sinh học còn được biết là mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ, bao gồm cả động vật nuôi trồng thủy sản. Vì lý do này, chế phẩm sinh học, bao gồm LAB đã được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản để cải thiện tình trạng sức khỏe hoặc hiệu suất tăng trưởng của vật nuôi. Probiotic có khả năng tăng hoạt động của enzyme tiêu hóa và cải thiện quá trình tiêu hóa thông qua việc tăng quần thể vi sinh vật có lợi, ức chế mầm bệnh gây chết hoặc điều chỉnh phản ứng miễn dịch, từ đó cải thiện khả năng tiêu hóa và hấp thu thức ăn. LAB đã được sử dụng thành công trong nuôi trồng nhiều loài thủy sản khác nhau, bao gồm cá da trơn và tôm thẻ chân trắng. LAB là một công nghệ tiềm năng để cải thiện sức khỏe và hiệu suất của động vật nuôi trồng thủy sản.

Hiệu suất tăng trưởng và tình trạng sức khỏe của vật chủ tăng lên nhờ sử dụng men vi sinh là do vi khuẩn có lợi trong ruột, có khả năng sản xuất nhiều chất dinh dưỡng khác nhau cho vật chủ, ngăn ngừa nhiễm trùng do mầm bệnh đường ruột và điều chỉnh các phản ứng miễn dịch. Ngoài ra, sự gia tăng vi khuẩn axit lactic và giảm vi khuẩn giống Vibrio ở tôm đã được phát hiện bằng phương pháp thông thường, phương pháp thạch đếm đĩa. Tuy nhiên, việc đếm khuẩn lạc bằng phương pháp đếm đĩa có độ chính xác hạn chế và đánh giá thấp số lượng khuẩn lạc vi sinh vật trong mẫu. Gần đây, phân tích metagenomics và tin sinh học đã cho phép hiểu rõ hơn về các cộng đồng vi sinh vật phức tạp trong ruột động vật. Tuy nhiên, quần thể vi sinh vật khi áp dụng chế phẩm sinh học trên tôm thẻ chân trắng vẫn còn hạn chế. Do đó, cần nghiên cứu sâu hơn bằng các phương pháp tiên tiến, chẳng hạn như giải trình tự thông lượng cao, để đánh giá và xác định chính xác những thay đổi trong cộng đồng vi sinh vật trong ruột tôm sau khi cung cấp men vi sinh.

Trong nghiên cứu này, Lactobacillus pentosus BD6 lần đầu tiên được phân lập từ phân chim bồ câu (Columba livia) để xác định hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả cho thấy hoạt tính đối kháng cao chống lại các mầm bệnh khác nhau, bao gồm cả mầm bệnh Vibrio ở tôm. Vì vậy, Lactobacillus pentosus BD6 được sử dụng dưới dạng probiotic đường miệng để cải thiện hiệu suất tăng trưởng và tình trạng sức khỏe của tôm thẻ chân trắng. Phân tích metagenomics cũng được sử dụng để xác định hệ vi sinh vật trong ruột tôm.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Chế phẩm Probiotic và hoạt tính kháng khuẩn chống lại mầm bệnh thủy sản

Phòng thí nghiệm, Lactobacillus pentosus BD6, phân lập từ phân chim bồ câu (Columba livia) có khả năng kháng khuẩn rất tốt. Đầu tiên, vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường De Man, Rogosa và Sharpe (MRS) trong 24 giờ ở nhiệt độ 37℃. Sau đó, vi khuẩn được thu hoạch bằng cách ly tâm ở tốc độ 1520×g trong 10 phút ở nhiệt độ 4 ℃ và rửa sạch rồi hòa tan lại trong sữa gầy 10% rồi bảo quản ở nhiệt độ −80℃. Tiếp theo, mẫu đông lạnh được sấy khô trong máy sấy đông lạnh và đồng nhất thành bột mịn. Cuối cùng, bột được đựng trong thùng nhựa và bảo quản ở nhiệt độ −4℃ cho đến khi sử dụng. Trước khi việc chuẩn bị khẩu phần ăn được hoàn tất, tỷ lệ sống của Lactobacillus pentosus BD6 được tính toán bằng phương pháp đổ đĩa sử dụng thạch MRS.

Để thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của Lactobacillus pentosus BD6, một phương pháp khuếch tán giếng đã được sử dụng. Các điều kiện nuôi cấy mầm bệnh được trình bày trong Bảng 1. Tất cả các mầm bệnh được lơ lửng riêng lẻ trong nước muối thông thường vô trùng (0,85 % NaCl) và được điều chỉnh ở mức ~10⁷ cfu/ ml. Một trăm huyền phù của từng mầm bệnh được trải trên môi trường dọc theo đĩa giấy trắng BBLTM (đường kính 6 mm, Becton, Dickinson và Company, Sparks, MD 21152 USA) có chứa phần nổi phía trên. Đĩa giấy trắng có/không có TSB vô trùng được sử dụng làm đối chứng. Tất cả các đĩa được ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ 27℃. Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng cách đánh giá đường kính vùng ức chế của vi khuẩn được thử nghiệm.

Bảng 1 Các mầm bệnh được sử dụng để thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn

2.2. Chuẩn bị khẩu phần ăn có chứa probiotic

5 khẩu phần ăn thử nghiệm, bao gồm khẩu phần ăn đối chứng không bổ sung men vi sinh và bốn khẩu phần ăn thử nghiệm có chứa Lactobacillus pentosus BD6 ở các liều lần lượt là 10⁷, 10⁸, 10⁹ và 10¹⁰ cfu/ kg. Công thức của khẩu phần thử nghiệm đã được chuẩn bị và các thành phần của khẩu phần thử nghiệm được liệt kê trong Bảng 2. Trước khi chuẩn bị khẩu phần, tất cả các thành phần đều được nghiền để đi qua sàng 60 lưới. Thức ăn được chuẩn bị dựa trên nhu cầu dinh dưỡng cho tôm thẻ chân trắng (37% protein và 7% lipid). Tất cả nguyên liệu được cho vào máy khuấy và thêm nước từ từ cho đến khi tạo thành khối bột cứng. Bột cứng thu được sau đó được đưa qua máy xay có khuôn để tạo thành các sợi giống như mì spaghetti và được cắt thành các viên có đường kính ~2 mm và chiều dài ~2 mm. Viên được sấy khô bằng điều hòa không khí ở nhiệt độ 20℃ khi độ ẩm thấp hơn 10 %. Các khẩu phần thí nghiệm được bảo quản riêng trong túi nhựa vô trùng trong suốt và giữ ở nhiệt độ 4℃ trước khi sử dụng. Khả năng tồn tại của probiotic trong khẩu phần thử nghiệm đã được đánh giá trước khi thử nghiệm và sau một tháng trong quá trình thử nghiệm, một đánh giá khác đã được thực hiện.

Bảng 2 Thành phần của khẩu phần thí nghiệm

2.3. Nuôi tôm

Tôm được cho ăn hàng ngày với khẩu phần đối chứng trong quá trình thích nghi, 3% thức ăn theo trọng lượng cơ thể và được nuôi 7 ngày trong bể xi măng (6 × 2 × 1 m) với 20% nước lợ. Sau khi thích nghi, 450 con tôm (trọng lượng ban đầu: 1,57 ± 0,05 g) được phân ngẫu nhiên vào các bể xi măng ba lớp (1,2 × 1,9 × 1,2 m) và mỗi bể chứa 30 con tôm. Các bể được trang bị bộ lọc nước liên tục, đá khí để sục khí và lò sưởi để kiểm soát nhiệt độ ở mức ~27 ℃. Tôm được cho ăn hai lần mỗi ngày trong 60 ngày với khẩu phần thử nghiệm chiếm 3% trọng lượng cơ thể. Trong thử nghiệm tăng trưởng, cân nặng được đo vào lúc bắt đầu thử nghiệm, lần lượt ở khoảng thời gian 15 ngày và 60 ngày. Theo đó, nồng độ amoniac-N và nitrit-N trong nước cũng được phân tích. Khi kết thúc thử nghiệm tăng trưởng, tôm được thu hoạch và cân riêng từng con. Các thông số về hiệu suất tăng trưởng được tính toán như sau:

Tỷ lệ sống (%) = (số tôm cuối cùng/số tôm ban đầu) × 100 %;

Tăng trọng (g) = (f_w – i_w);

Phần trăm tăng trọng (%) = ((f_w – i_w)/i_w) × 100 %;

Tốc độ tăng trưởng cụ thể = (ln f_w – ln i_w) × 100/ngày; Và

Hiệu quả sử dụng thức ăn = (tăng trọng × tổng tôm/tổng thức ăn sử dụng).

f_w: trọng lượng cuối cùng; i_w: trọng lượng ban đầu

2.4. Đánh giá tình trạng sức khỏe tâm

Khi kết thúc thử nghiệm tăng trưởng, tôm được lấy mẫu để đánh giá tình trạng sức khỏe, bao gồm thử nghiệm cảm nhiễm với mầm bệnh tiềm ẩn là Vibrio alginolyticus và phân tích thông số miễn dịch: tổng số lượng tế bào máu (THC), hoạt tính phenoloxidase (PO), superoxide effutase ( SOD), hoạt động bùng nổ hô hấp (RB), hoạt động lysozyme (LYS) và hoạt động thực bào (PA), đồng thời xác định các biểu hiện gen liên quan đến miễn dịch: prophenoloxidase I và II (proPOI và proPOII), lipopolysacarit và β-1,3-glucan -protein liên kết (LGBP) và penaeidin-4 (PEN4).

2.5. Thử nghiệm cảm nhiễm

V. alginolyticus và V. parahaemolytics phân lập từ tôm bị bệnh đã được sử dụng cho các thử nghiệm cảm nhiễm. Vi khuẩn được nuôi cấy trên tryptic soy broth (TSB) được bổ sung 1,5 % NaCl trong 24 giờ ở nhiệt độ 27 ℃, sau đó được thu hoạch bằng cách ly tâm trong 10 phút ở 2370×g và nhiệt độ 4 ℃. Viên này được rửa sạch và hòa tan lại trong nước muối thông thường vô trùng và điều chỉnh thành 10⁷ cfu/ ml. Nồng độ huyền phù vi khuẩn được xác định bằng cách đo OD ở bước sóng 595 nm. OD = 1,0 tương đương với 10⁹ cfu/ ml.

Đối với thử nghiệm cảm nhiễm đầu tiên, 30 con tôm ở giai đoạn lột xác từ mỗi nhóm thử nghiệm cho ăn đã được sử dụng. Mỗi nhóm được thực hiện ba lần và mỗi lần lặp lại bao gồm 10 con tôm. Tôm được tiêm 10 µl dung dịch V. alginolyticus, thu được 10⁵ cfu /g tôm. Sau khi tiêm, tôm được tách thành 15 bể nuôi. Mỗi bể chứa 60 L nước lợ (20 ‰), được trang bị đá khí để sục khí. Tôm chết được ghi nhận hàng ngày.

Do Lactobacillus pentosus, BD6 có hoạt tính kháng khuẩn tuyệt vời chống lại mầm bệnh và tiềm năng chữa bệnh của Lactobacillus pentosus BD6 đã được xác định. Việc lây nhiễm thực nghiệm được thực hiện bằng cảm nhiễm bằng miệng. Huyền phù V. parahaemolytics được trộn với khẩu phần ăn để tạo ra mức 10⁶ cfu/ g khẩu phần ăn. Tôm được cho ăn theo tỷ lệ bằng nhau giữa khẩu phần bổ sung men vi sinh (10¹⁰ cfu/ kg) và khẩu phần chứa mầm bệnh (kết quả là 10⁵ cfu/g tôm) theo 3% tổng trọng lượng cơ thể của tôm. Sau khi cảm nhiễm mầm bệnh, tôm được cho ăn khẩu phần ăn có chứa men vi sinh ở mức 10¹⁰ cfu/ kg trong 1 tuần. Để kiểm soát cảm nhiễm, tôm được cho ăn bằng khẩu phần ăn có mầm bệnh và sau đó được cho ăn bằng khẩu phần ăn đối chứng. Sau đó, tôm được tách thành 6 bể nuôi. Mỗi bể chứa 60 L nước lợ (20 ‰), được trang bị đá khí để sục khí. Tỷ lệ chết tích lũy của tôm được ghi nhận hai lần mỗi ngày. Tôm được cho ăn bằng khẩu phần ăn có chứa men vi sinh mà không cần cảm nhiễm bằng miệng được coi là đối chứng.

2.6. Thông số miễn dịch

Để phân tích thông số miễn dịch, tôm ở giai đoạn giữa các lần lột xác được chọn để phân tích: sáu con từ mỗi nhóm để đo THC, PO, RB, SOD và LYS của chúng; 6 con tôm khác từ mỗi nhóm để đo PA.

Để chuẩn bị hemolymp, 100 μl hemolymp được rút ra bằng ống tiêm chứa 900 μl dung dịch chống đông máu (30 mM trisodium citrate, 0,34 M NaCl và 10 mM EDTA; pH 7,55; và độ thẩm thấu của dung dịch chống đông máu được điều chỉnh bằng glucose đến 780 mOsm/ kg). Sau đó, dịch hemolymp pha loãng được chuyển vào ống vô trùng và đặt trên đá.

Hỗn hợp chất chống đông máu-hemolymp được nhỏ giọt trên cả hai mặt của phiến đo huyết sắc tố để xác định THC bằng cách sử dụng kính hiển vi tương phản pha ngược (Leica DMIL, Leica Microsystems, Wetzlar, Đức). Mỗi mẫu được đo lặp lại.

Hoạt tính PO được đo dựa trên sự hình thành dopachrome được tạo ra bởi L-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) bằng cách sử dụng máy đo quang phổ. Chất chống đông máu-hemolymp (1 ml), được điều chế như mô tả ở trên, được ly tâm trong 10 phút ở 300×g và ở 4 ℃. Viên này được rửa và treo lại trong dung dịch đệm 200 μl cacodylate-citrate (natri cacodylate 0,01 M, natri clorua 0,45 M và trisodium citrate 0,1 M; pH 7,0) rồi ly tâm lại. Sau khi ly tâm, viên được treo lại trong dung dịch đệm cacodylat 200 μl (natri cacodylat 0,01 M, natri clorua 0,45 M, canxi clorua 0,01 M và magie clorua 0,26 M; pH 7,0). 100 µl huyền phù tế bào được ủ với 50 µl trypsin (1 mg/ ml) trong 10 phút ở nhiệt độ 25 ℃. Sau đó, 50 µl L-DOPA được thêm vào, cùng với việc bổ sung 800 µl đệm cacodylate 5 phút sau đó. OD được đo bằng máy quang phổ (Jasco V-630, Hachioji, Tokyo, Nhật Bản) ở bước sóng 490nm. Hoạt tính PO cơ bản được phân tích với huyền phù tế bào còn lại (100 μl) để ủ với 50 μl đệm cacodylate thay vì trypsin trước khi bổ sung 50 μl L-DOPA. Điều kiện phản ứng như mô tả ở trên.

Phân tích RB của tế bào máu dựa trên việc khử tetrazolium xanh nitro (NBT) thành formazan do anion superoxide (O₂^–) gây ra. Đĩa 96 giếng được phủ bằng dung dịch poly-lysine (0,2 %, 100 μl) trước khi lắng đọng dung dịch hemolymp pha loãng (100 μl). Các đĩa sau đó được ly tâm ở tốc độ 300 × g trong 15 phút và chất lỏng nổi trên bề mặt được loại bỏ. Sau đó, 100 μl zymogen được thêm vào và phản ứng trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Tế bào máu được rửa ba lần bằng 100 μl dung dịch Hank, sau đó phản ứng với 100 μl dung dịch NBT (0,3%) trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau phản ứng, loại bỏ dung dịch NBT, rửa ba lần bằng 100 µl metanol (70%) và để khô trong không khí. KOH (2 M, 120 μl) và DMSO (140 μl) được sử dụng để hòa tan formazan. Mỗi mẫu được thực hiện ba lần. OD ở bước sóng 630nm được đo bằng cách sử dụng máy quang phổ vi bản (Spectramax® 190, Sunnyvale, CA, USA).

Để phân tích các hoạt động SOD và LYZ, 100 μl hemolymp pha loãng được ly tâm trong 30 phút ở 300×g và 4 ℃; và sau đó viên được rửa hai lần bằng dung dịch muối đệm phốt phát (PBS, pH 7,5), đồng nhất trong PBS và ly tâm trong 30 phút ở 10.000×g ở 4 ℃. Chất nổi phía trên (HLS) được chuyển sang ống mới và đặt trên đá. Tổng hàm lượng protein trong HLS đã được phân tích bằng cách sử dụng thuốc thử xét nghiệm protein Bio-Rad (Phòng thí nghiệm Bio-Rad, Mississauga, ON, Canada) và albumin huyết thanh bò làm chất chuẩn.

Hoạt tính HLS SOD được phân tích dựa trên khả năng ức chế quá trình khử quang hóa của tetrazolium xanh nitro (NBT). Một 625 μl hỗn hợp phản ứng (dung dịch đệm 150 mM photphat (pH 7,8), 120 mM methionine, 7,5 μM riboflavin, 630 μM NBT và 1 mM EDTA) được trộn với HLS (125 μl) và PBS (250 μl). Phản ứng được thực hiện trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Đọc độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 560 nm. Một đơn vị hoạt độ SOD được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để tạo ra sự ức chế 50% tốc độ giảm NBT. Hoạt tính cụ thể được biểu thị bằng đơn vị (mg protein) −1.

Việc phân tích hoạt động LYZ của tế bào máu được thực hiện dựa trên phương pháp đo độ đục. 10 µL HLS được trộn với Micrococcus lysodeikticus 0,02% (Sigma, St. Louis, MO, USA) trong dung dịch đệm natri photphat (0,05 M, pH 6,2), sau đó ủ ở 25 ℃. OD ở bước sóng 530nm được phát hiện ở phút đầu tiên và phút thứ sáu bằng cách sử dụng máy quang phổ UV-Vis V-630 (Jasco). Đường cong chuẩn của LYZ từ lòng trắng trứng gà (L6876, Sigma) đã được sử dụng để tính toán hoạt động của LYZ trong HLS.

Phương pháp Bradford được áp dụng để phân tích nồng độ protein trong HLS bằng cách sử dụng thuốc thử xét nghiệm protein Bio-Rad (Phòng thí nghiệm Bio-Rad, Mississauga, ON, Canada). Albumin huyết thanh bò được coi là tiêu chuẩn để tính toán nồng độ protein trong HLS.

Hoạt động thực bào của tế bào máu cũng được xác định. Các hạt huỳnh quang (5 × 10⁶ hạt huỳnh quang trong 1 ml PBS) được tiêm vào xoang bụng của tôm ở mức 10⁵ hạt/ tôm. Sau đó, tôm được sử dụng ở đây được nuôi tạm thời trong bể chứa 40 L nước mặn (25‰) trong 2 giờ. Hemolymp của tôm được lấy ra như mô tả ở trên và trộn với dung dịch chống đông theo tỷ lệ 1:9. Sau đó, hemolymp đã pha loãng (100 μl) được trộn với 0,1 % paraformaldehyde (100 μl) ở 4℃. Sau khi cố định tế bào máu, 50 μl mẫu được nạp vào phiến kính bằng cách sử dụng máy ly tâm cytospin trong 3 phút ở tốc độ 113 × g. Khi phiến kính được làm khô trong không khí, nó được nhuộm bằng 0,1% propidium iodide trong 10 phút và sau đó được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang (Leica DM2500, Leica Microsystems, Wetzlar, Đức). 200 tế bào máu được đếm ngẫu nhiên. Hoạt động thực bào (PA) được biểu thị như sau:

PA (%) = (Tế bào máu thực bào / Tổng số tế bào máu) × 100%

2.7. Biểu hiện gen liên quan đến miễn dịch

Việc chiết tách tổng số RNA của hemolymp bằng thuốc thử REzol™ C & T (AMRESCO, Solon, OH, USA). Sau khi tách toàn bộ RNA, quá trình tổng hợp DNA bổ sung chuỗi đầu tiên (cDNA) được tiến hành bằng cách sử dụng SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen) với mồi oligod (T)18. Các điều kiện phản ứng được tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Các cặp mồi dùng để phân tích biểu hiện gen proPO I, proPO II, LGBP, PEN4 và β-actin lần lượt là POIF: 5′ – GCCTTGGCAACGCTTTCA-3′ và POIR: 5′ -CGCGCATCAGTTCAGTTTGT-3′, POIIF: 5′ – ACCACTGGCACTGGCACCTCGTCT-3′ và POIIR: 5′ -TCGCCAGTTCTCGAGCTTCTGCAC-3′, LGBPF: 5′ -CATGTCCAACTTCGCTTTCAGA-3′ và LGBPR: 5′ -ATCACCGCGTGGCATCTT-3′, PEN4F: 5′ -ATGCTACGGAATTCCCTCCT-3′ và PEN4R: 5′ -ATCCTTGCAACGCATAGACC-3′, và actinF: 5′ -GAGCAACACGGAGTTCGTTGT-3′ và actinR: 5′ -CATCACCAACTGGGACGACATGG-3′.

Quá trình khuếch đại được tiến hành trong một đĩa 96 giếng với thể tích phản ứng 20 μl chứa 10 μl 2 × SYBR Green Master Mix (Qiagen, Valencia, CA, USA), 0,8 μl mỗi mồi thuận và mồi ngược (10 mM), 2 μl cDNA (dưới dạng mẫu) và 6,4 μl nước DEPC. Cấu hình nhiệt cho PCR thời gian thực là 50 ℃ trong 2 phút và 95 ℃ trong 10 phút, sau đó là 40 chu kỳ 95 ℃ trong 15 giây và 60 ℃ trong 1 phút. Phản ứng trộn với nước cất thay vì mẫu được dùng làm đối chứng âm tính. Mỗi mẫu được phân tích lặp lại. Số lượng biểu hiện gen mục tiêu tương đối được tính toán bằng cách sử dụng phương pháp 2^−ΔΔCt.

2.8. Phân tích hệ vi sinh vật đường ruột tôm

Khẩu phần ăn bổ sung men vi sinh Lactobacillus pentosus BD6 (10¹⁰ cfu/kg) đã làm tăng sự đa dạng của hệ vi sinh vật đường ruột ở tôm thẻ chân trắng. Tổng số DNA vi khuẩn trong ruột được chiết xuất bằng cách sử dụng Bộ Mini chiết xuất DNA bộ gen mô FavourPre TM (Favorgen Biotech, Pingtung, Đài Loan) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Việc trích xuất DNA của ruột tôm được thực hiện ba lần (mỗi lần sao chép từ ba con tôm được gộp lại với nhau). Sau khi xác định độ tinh khiết DNA bằng máy quang phổ NanoDrop, vùng V3–V4 của gen 16 S rRNA được khuếch đại bằng phương pháp PCR với các đoạn mồi đặc hiệu (mồi xuôi (S17): 5′ -TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′ và mồi ngược (A21): 5′ – GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′. Trình tự thông lượng cao cho bộ khuếch đại đủ điều kiện đã được thực hiện với trình sắp xếp NGS, nền tảng Illumina MiSeq^® (Illumina) tại Welgene Biotech CO., Ltd. (Đài Bắc, Đài Loan). Đọc theo cặp (2 × 300-bp) được chỉ định cho các mẫu dựa trên một mã vạch duy nhất và bị cắt bớt bằng cách cắt bỏ mã vạch và trình tự mồi. Các lần đọc ở đầu cặp Illumina được căn chỉnh theo các chuỗi tham chiếu dài bằng Bowtie 2. Các chuỗi đã được lọc, các chuỗi có chất lượng kém hơn đã bị loại bỏ và các chuỗi mồi có gắn thẻ mã vạch đã bị cắt bỏ. Các thẻ thô sau đó được tạo ra bởi FLASH. Trình tự khảm tiềm năng được phân tích bằng cách sử dụng Mothur. Các thẻ hiệu quả được lọc và phân cụm thành các đơn vị phân loại vận hành (OTU) theo mức độ tương đồng nucleotide là 97%. Chú thích phân loại của OTU được thực hiện bằng cách sử dụng trình phân loại Dự án cơ sở dữ liệu Ribosomal (RDP). Các mức phân loại từ ngành đến chi đã được phân tích và kết quả phân cụm được hiển thị bằng cách quan sát sơ đồ phân tích thành phần chính (PCA). Nguyên tắc phân tích dữ liệu được sử dụng để xác định mức độ chồng chéo của quần thể vi sinh vật giữa các nhóm khẩu phần ăn. QIIME (http://qiime.org/scripts/alpha_diversity.html ) đã được áp dụng để tính toán chi, độ đồng đều của Pielou (J), chỉ số đa dạng Shannon và độ phong phú loài của Margalef (d). Các biểu đồ vectơ riêng PCA và biểu đồ ưu thế tích lũy (%) được phân tích bằng cách sử dụng Quy trình Plymouth trong Nghiên cứu sinh thái đa biến (PRIMER) Phiên bản 6.1.5.

Theo Shieh-Tsung Chiu, Tah-Wei Chu, Tohap Simangunsong, Rolissa Ballantyne, Chiu-Shia Chiu, Chun-Hung Liu

Nguồn: https://www.academia.edu/106466370/Probiotic_Lactobacillus_pentosus_BD6_boost_the_growth_and_health_status_of_white_shrimp_Litopenaeus_vannamei_via_oral_administration

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Bình Minh Capital

Xem thêm:

• Sử Dụng Đồng Sunfat Trong Ao Nuôi Cá, Tôm
• Ảnh Hưởng Của Ph, Độ Kiềm Và Độ Cứng Đến Tăng Trưởng Và Tỷ Lệ Sống Của Tôm Thẻ Chân Trắng
• Dự Án Sử Dụng Cảm Biến Sinh Học Chi Phí Thấp Để Phát Hiện Mầm Bệnh