English
Kỹ Thuật Nuôi, Tin tức
Phát hiện ký sinh trùng đường ruột Amip trên tôm thẻ chân trắng
Kết quả nghiên cứu hữu ích như phương pháp sàng lọc sơ cấp
Dấu hiệu đại thể của tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) nuôi trong trang trại tuần hoàn khép kín và bị nhiễm đơn bào amip tự nhiên. Tôm có biểu hiện bị tổn thương nặng ở vỏ giáp đầu ngực; (A) mang đen, (B) mất phiến mang và vỏ giáp đầu ngực bị ăn mòn.
Động vật nguyên sinh Paramoeba sp. (tương tự với Neoparamoeba sp.) là ký sinh trùng đơn bào amip phổ biến, thường sống tự do ở vùng nước biển và gây bệnh nhiều nhất ở cá nuôi. Loài P. perurans xâm nhập vào mang và gây ra bệnh amip ở mang (AGD) ở cá hồi nuôi trong trang trại và ảnh hưởng chủ yếu đến ngành công nghiệp cá hồi Tasmania ở Đại Tây Dương, với mức thiệt hại điển hình từ 10 đến 20% sản lượng. Cho đến nay, AGD đã được ghi nhận ở 15 loài cá cuối cùng thuộc 11 chi khác nhau và nhiễm trùng ở cá P. perurans dẫn đến các phản ứng tăng sinh tế bào trong mang, bao gồm tăng sản biểu mô, phì đại, phù nề và hình thành túi xen kẽ các lớp, xuất hiện dưới dạng các đốm và mảng chất nhầy màu trắng trên bề mặt mang.
Đánh giá tổng thể bệnh lý của mang thường được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán AGD, nhưng việc kiểm tra mô học tiếp theo được khuyến nghị để cải thiện độ chính xác của chẩn đoán. Ngoài ra, các phương pháp chẩn đoán phân tử dựa trên xét nghiệm PCR thông thường nhắm mục tiêu trình tự rRNA tiểu đơn vị nhỏ (SSU rRNA) có sẵn để chẩn đoán AGD.
Nhiều loài Paramoeba cũng đã được ghi nhận ở một số loài giáp xác và da gai, chẳng hạn như tôm hùm, cua và nhím biển. Ở những vật chủ này, nhiễm trùng nặng có liên quan đến cái chết của vật chủ và dẫn đến thiệt hại kinh tế đáng kể. Các bệnh nhiễm trùng cũng được báo cáo ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ như trai, nhưng chúng có nhiều khả năng là ổ chứa môi trường tiềm năng cho động vật nguyên sinh này.
Thiết lập nghiên cứu
Tôm Thái Bình Dương trưởng thành (trọng lượng trung bình 30g) từ một trại sản xuất tôm giống ở Bắc Mỹ cho thấy chán ăn, lờ đờ và suy hô hấp. Tỷ lệ chết lên đến là 62,75% sau 120 ngày kể từ ngày thả và tôm nhiễm bệnh có mang bị đen, hư hại phiến mang lamellae và vỏ đầu ngực bị ăn mòn (xem hình trên).
Từ những dữ liệu này, các nhà khoa học nghi ngờ nhiễm nấm do loài Fusarium được báo cáo trước đây gây ra bệnh đen mang ở động vật giáp xác, như tôm he, tôm sú và tôm hùm. Tuy nhiên, ký sinh trùng đơn bào amip đã được quan sát bằng cách quan sát trực tiếp trên phiến kính ướt (Hình 1). Các mẫu tôm sắp chết được thu thập với khoảng thời gian không đều nhau, được cố định trong dung dịch cố định AFA của Davidson hoặc ethanol 95%, và được kiểm tra thêm bằng các phương pháp mô bệnh học, PCR và ISH.
Hình 1: Các mẫu thu được từ các mảnh vỡ ướt của mang. (A) Các biến thể về hình thái của amip và (B) các amip sống tự do riêng lẻ. Thanh tỷ lệ = 20 Pha.
Kết quả và thảo luận: Xét nghiệm mô bệnh học (H&E)
Phát hiện quan trọng nhất trong quá trình kiểm tra bằng kính hiển vi của các mẫu được nghiên cứu là sự hiện diện của ký sinh trùng amip. Sự phá hoại của loài ký sinh trùng này được tìm thấy chủ yếu ở mang có mức độ nghiêm trọng G4 (Hình 2A–C), và quan sát thấy hiện tượng tăng sản trên diện rộng và hình thành các khoảng trống giữa các lớp. Nông dân cho biết tôm bị nhiễm bệnh có hiện tượng lờ đờ, thiếu oxy và cuối cùng là chết có thể liên quan đến tổn thương mang (cơ quan hô hấp). Hình 2A cho thấy nhân amip có lõi lưỡng tính được bao quanh bởi một vòng ưa bazơ không đều và thể ký sinh có tế bào chất và không bào ưa eosin, cho thấy amip có quan hệ họ hàng gần với các thành viên của bộ Dactylopodida, và có thể với chi Paramoeba, theo Sühnel và cộng sự (2014).
Hình 2: Nhiễm trùng amip (Paramoeba sp.) được tìm thấy trong một số mô bằng cách kiểm tra mô bệnh học và lai tạo tại chỗ. Thuốc nhuộm Mayer–Bennett hematoxylin–eosin–phloxine; (A), (B) và (C) mang, (D) tuyến râu, (E) mô dưới da, (F) biểu mô biểu bì và (G) bao ngoài bó sợi thần kinh. Bằng cách lai tại chỗ với đầu dò gen được đánh dấu digoxigenin, kết tủa màu xanh đậm cho thấy sự hiện diện của ký sinh trùng (H) trong tuyến râu. Amip đơn bào có hình dạng phẳng và không đều, thể tư dưỡng (đường kính khoảng 25 đến 30 mm; mũi tên đen), dạng nang (đường kính nhỏ hơn 10 mm; đầu mũi tên đen) và phóng đại thể tư dưỡng cho thấy nội chất dạng hạt với (V) không bào , (N) nhân, (PS) ký sinh trùng và ngoại chất với giả hành (PP). Thanh tỷ lệ = 30 mm.
Ngoài ra, các thể tư dưỡng có hình dạng phẳng và không đều với bức xạ pseudopodia (đường kính khoảng 25 đến 30 μm) chủ yếu được quan sát thấy. Sự hiện diện của pseudopodia số hóa, thiếu u nang (đường kính dưới 10 μm) và môi trường sống ở biển cũng xác định amip là chi Paramoeba, theo Kent và cộng sự (1988). Những ký sinh trùng amip này cũng được quan sát thấy ở các cơ quan khác, bao gồm tuyến râu, cơ quan bạch huyết, biểu mô biểu bì và mô dưới da của các phần phụ và mô liên kết bao quanh dây thần kinh bụng của các mẫu thử nghiệm, với mức độ nghiêm trọng từ G1 đến G4 (Hình 2D– G).
Xét nghiệm PCR và phân tích trình tự
Các bộ khuếch đại mạnh (bộ khuếch đại là một đoạn DNA hoặc RNA là nguồn và/hoặc sản phẩm của các sự khuếch đại hoặc lặp lại) đã được phát hiện trong tôm thử nghiệm (năm mẫu đại diện), bằng xét nghiệm PCR nhắm mục tiêu trình tự SSU rRNA (Hình. 3). Kết quả cho thấy trình tự nucleotide giống 100% với trình tự của Paramoeba sp. ( Neoparamoeba sp.) từ một số loài giáp xác biển và da gai. Và không có phản ứng chéo với DNA bộ gen từ tôm thẻ chân trắng và tôm khác ( P. monodon, P. indicus, L. stylirostris, và M. rosenbergii), giun nhiều tơ, mực và Artemia spp., hoặc với các ký sinh trùng khác trên tôm bằng phép thử độ đặc hiệu.
Hình 3: Xét nghiệm PCR nhắm vào các trình tự rRNA tiểu đơn vị nhỏ. Khuếch đại mạnh (131 bp) với DNA của các mô mang từ tôm bị nhiễm Paramoeba sp. (Lô 1 đến 5), tôm không có mầm bệnh cụ thể (Lô 6), đối chứng không phải mẫu (Lô 7) và 1-kb Thang DNA Plus (làn M).
Chúng tôi cũng đã thực hiện một nghiên cứu phân tích gen để xác định mối quan hệ giữa các loài Paramoeba sp. từ tôm và các loài amip khác. Trong dòng thu được, trình tự SSU rRNA từ Paramoeba sp. được nhóm lại cùng với các trình tự từ bộ Dactylopodida, đặc biệt là họ Paramoebidae.
Lai tạo tại chỗ
Phương pháp ISH cũng có thể được sử dụng để xác định tác nhân gây bệnh nhiễm trùng đơn bào. Đối với ISH, đầu dò gen giống Paramoeba được tạo ra từ trình tự SSU rRNA của tôm nhiễm amip và mẫu này được lai với các tế bào amip trong mẫu đại diện (Hình 2H), tương ứng với kết quả mô bệnh học. Mẫu dò dường như có tính đặc hiệu cao và không thấy phản ứng nào trong bất kỳ mô nào được chuẩn bị từ tôm SPF (dữ liệu không được hiển thị).
Cho đến nay, ký sinh trùng đơn bào amip Paramoeba sp. đã được báo cáo ở một số loài giáp xác biển, bao gồm cả tôm hùm và cua Mỹ, nhưng không có ở tôm nuôi. Nghiên cứu này là báo cáo đầu tiên về sự lây nhiễm của ký sinh trùng đơn bào amip Paramoeba sp., trong mang của L. vannamei được nuôi trong một trại sản xuất tôm giống ẩn danh ở Bắc Mỹ. Nhiễm trùng amip rất có thể là do các yếu tố căng thẳng như nhiệt độ nước tăng và/hoặc độ mặn cao, kết hợp với mật độ động vật thủy sinh cao, tạo lợi thế cho loài protozoan này hiện diện tự nhiên trong môi trường biển. Theo nông dân, độ mặn đã giảm từ 34 xuống 10 ppt do các vấn đề về thiết bị máy móc, vì vậy căng thẳng có thể đã gây ra sự lây nhiễm ký sinh trùng ở tôm.
Kết luận
Tôm bị nhiễm amip có biểu hiện chán ăn, lờ đờ, suy hô hấp, vỏ bị ăn mòn và mang bị đen. Dưới kính hiển vi, các đặc điểm mô bệnh học bao gồm hình thái điển hình của động vật nguyên sinh amip biểu hiện nội chất dạng hạt với không bào, nhân, ký sinh trùng và ngoại chất với pseudopodia. Những đặc điểm này gợi ý rằng ký sinh trùng có liên quan đến bộ Dactylopodida, có thể là một loài Paramoeba và điều này đã được xác nhận bằng phân tích trình tự SSU rRNA, xét nghiệm PCR và lai tạo tại chỗ (ISH).
Ở tôm, nhiễm trùng amip đã dẫn đến tỷ lệ chết đáng kể và thiệt hại kinh tế liên quan. Do đó, các xét nghiệm chẩn đoán ISH và PCR được phát triển trong nghiên cứu này có thể cung cấp dữ liệu thông tin cho người nuôi tôm và có thể được sử dụng làm phương pháp sàng lọc ban đầu đối với động vật nguyên sinh amip ở tôm.
Nghiên cứu này cung cấp dữ liệu hữu ích cho các nhà sản xuất tôm và giúp nông dân theo dõi tình trạng nhiễm trùng amip trong các trang trại nuôi tôm. Ở tôm được kiểm tra, ký sinh trùng có đặc điểm mô học của Paramoeba sp., nhưng không phát hiện thấy dải PCR nào đối với mồi được tạo ra từ P. perurans, P. pemaquidensis hoặc P. branchiphila spp. Do đó, nó có thể là một loài Paramoeba mới lây nhiễm cho tôm. Công việc bổ sung là cần thiết để xác định loài và phát triển các phương pháp xác định loài cụ thể đối với tôm nuôi nhiễm amip.
Theo Jee Eun Han, Ji Hyung Kim, Kyeong Yeon Kim, Young Seo Lee.
Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Bình Minh Capital
Xem thêm:
(Phần 3) Biofilm Và Các Biện Pháp Kiểm Soát Chúng
(Phần 4) Biofilm Và Các Biện Pháp Kiểm Soát Chúng
Một Số Thách Thức Trong Trang Trại Nuôi Tôm Ở Phía Bắc Bali