Phần 2: Vai trò của hormone tập trung sắc tố đỏ trong việc điều hòa hệ thống thần kinh nội tiết cuống mắt ở cua bùn Scylla paramamosain

3. Kết quả

3.1. Phân tích trình tự và nhân bản cDNA của RPCHR

Trình tự cDNA RPCHR của S. paramamosain là 2426 bp, bao gồm ORF 1443 bp mã hóa tiền chất 481 axit amin, với trọng lượng phân tử được tính toán là 54,21 kDa và điểm đẳng điện lý thuyết là 8,74 (Hình 1). Phân tích máy chủ dự đoán xuyên màng TMHMM cho thấy nó có 7 cấu trúc xuyên màng (Hình 1, 2A, B, C) và phân tích tương đồng chỉ ra rằng protein này thuộc họ thụ thể liên kết với protein G (Hình 2A, B, C).

3.2. Phân tích cây phát sinh loài và căn chỉnh nhiều lần

Căn chỉnh nhiều lần cho thấy RPCHR có tính tương đồng cao với trình tự RPCHR/GnRHR/AKHR của cua bờ xanh C. maenas và các loài chân khớp khác (Hình 3). Phân tích phát sinh loài cho thấy RPCHR ở S. paramamosain được nhóm vào một nhóm với C. maenas (Hình 4). Cấu trúc 3D của RPCHR ở S. paramamosain tương tự như cấu trúc của C. maenas và tỷ lệ tương đồng là 94,28% (Hình 5).

3.3. Biểu hiện của RPCHR

Để khảo sát sơ bộ các chức năng tiềm ẩn của RPCHR ở S. paramamosain, chúng tôi đã phát hiện mức độ biểu hiện của RPCHR trong 12 mô. Kết quả của chúng tôi cho thấy RPCHR phân bố rộng rãi trong nhiều mô khác nhau bao gồm hạch buồng trứng và hạch cuống mắt, với cơ quan hàm dưới có biểu hiện cao nhất, cho thấy nó có thể có nhiều chức năng (Hình 6).

3.4. Tác động của việc tiêm RPCH lên biểu hiện gen CHH

Để làm sáng tỏ chức năng của RPCH, peptide RPCH trưởng thành đã được tiêm vào cua bùn. Biểu hiện RPCHR tăng đáng kể (P < 0,05; P < 0,001; P < 0,0001) sau 6 giờ, 9 giờ và 12 giờ so với nhóm đối chứng (Hình 7A) và biểu hiện VIH giảm đáng kể (P < 0,01; P < 0,05; P < 0,0001) sau 6 giờ, 9 giờ, 12 giờ và 24 giờ (Hình 7B). Biểu hiện MIH tăng lên sau 3 giờ, 6 giờ và 12 giờ sau khi tiêm so với nhóm đối chứng được tiêm nước muối cua (Hình 7C). Tương tự như vậy, biểu hiện CHH3 tăng lên (P < 0,05; P < 0,0001) sau 3 giờ và 24 giờ sau khi tiêm peptide RPCH (Hình 7D).

3.5. Tác động của việc hạ gục RPCH đối với biểu hiện gen CHH

Sau khi can thiệp với RPCH dsRNA, biểu hiện RPCH giảm 58,5% ở hạch cuống mắt sau 48 giờ so với đối chứng trống (P < 0,01). Không có sự khác biệt đáng kể giữa đối chứng âm tính (được xử lý bằng GFP dsRNA) và đối chứng trống (Hình 8A). Biểu hiện VIH được điều chỉnh tăng đáng kể (P < 0,05; Hình 8C). Đồng thời, biểu hiện RPCHR, MIH và CHH3 giảm đáng kể sau khi tiêm RPCH dsRNA (P < 0,01; P < 0,05; P < 0,0001; Hình 8B, D, E).

4. Thảo luận

Hormone tập trung sắc tố đỏ được báo cáo là có liên quan đến việc điều chỉnh nhiều chức năng sinh lý ở động vật chân khớp thông qua các thụ thể liên kết của nó, bao gồm kiểm soát các thay đổi về màu sắc cơ thể và chuyển động của các hạt sắc tố, thúc đẩy sự trưởng thành của tuyến sinh dục và làm tăng lượng đường trong máu ở động vật giáp xác (Zeng và cộng sự, 2016; Alexander và cộng sự, 2018; Wei và cộng sự, 2021). Để minh họa chức năng của RPCH trong S. paramamosain, các trình tự tiền thân của RPCHR từ S. paramamosain đã được xác định trong nghiên cứu này. Nghiên cứu này cho thấy RPCHR là một thụ thể liên kết với protein G có cấu trúc xuyên màng 7 điển hình, phù hợp với các phát hiện ở C. maenas (Alexander và cộng sự, 2018). Trong cây phát sinh loài được xây dựng, RPCHR của S. paramamosain tập hợp lại với RPCHR của C. maenas và GnRHR của P. vannamei thành một đơn vị duy nhất, tách biệt rõ ràng với GnRHR/AKHR của các loài chân khớp khác. Điều này chỉ ra rằng RPCHR được bảo tồn cao ở giáp xác mười chân, gợi ý thêm rằng RPCH có thể có chức năng tương tự như GnRH. Kết quả này tương tự như kết quả được báo cáo ở C. maenas (Alexander và cộng sự, 2018). Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng RPCH ở S. paramamosain không chỉ điều chỉnh sự thay đổi màu sắc và sự phát triển của buồng trứng mà còn tham gia vào việc điều chỉnh các chức năng sinh lý khác (Zeng và cộng sự, 2016). Nghiên cứu hiện tại tiếp tục chứng minh rằng RPCHR được phân bố rộng rãi trên nhiều mô khác nhau, bao gồm buồng trứng và hạch cuống mắt, được biết là tổng hợp, giải phóng và lưu trữ nhiều loại hormone neuropeptide như VIH, MIH và CHH điều chỉnh sự phát triển của buồng trứng, lột xác và lượng đường trong máu. Những phát hiện này cho thấy rằng sự liên kết của RPCH với các thụ thể được cho là của nó có thể đóng vai trò trong việc điều chỉnh nhiều quá trình sinh lý khác nhau, bao gồm sự phát triển của buồng trứng, lột xác và lượng đường trong máu. Một hiện tượng tương tự đã được mô tả ở C. maenas, tức là RPCHR được biểu hiện cao không chỉ trong các mô thần kinh mà còn trong buồng trứng (Alexander và cộng sự, 2018). Điều thú vị là RPCHR được biểu hiện cao nhất ở cơ quan hàm dưới ở S. paramamosain, cho thấy RCPH có thể đóng vai trò có ảnh hưởng đến sự phát triển buồng trứng thông qua cơ quan hàm dưới và một hiện tượng tương tự đã được báo cáo ở P. clarkii, tức là RCPH có thể hướng dẫn sự phát triển buồng trứng bằng cách kích thích tổng hợp MF ở cơ quan hàm dưới (Sarojini và cộng sự, 1995).

VIH ức chế quá trình tổng hợp vitellogenin ở buồng trứng và gan tụy, do đó ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển của tuyến sinh dục (Devaraj và cộng sự, 2012). Trong nghiên cứu này, kết quả thực nghiệm in vivo cho thấy peptide RPCH trưởng thành ức chế biểu hiện VIH ở hạch cuống mắt, cho thấy RPCH có thể thúc đẩy sự phát triển của tuyến sinh dục bằng cách ức chế biểu hiện VIH ở hạch cuống mắt. Phù hợp với các kết quả trước đây, tức là chỉ số tuyến sinh dục-thể xác, chỉ số gan tụy-thể xác và mức độ biểu hiện Vg của S. paramamosain được tiêm peptide RPCH được tăng cường đáng kể, từ đó thúc đẩy quá trình trưởng thành của buồng trứng (Zeng và cộng sự, 2016). Tương tự, điều trị in vivo bằng RPCH kích thích hiệu quả quá trình trưởng thành giảm phân của tế bào trứng ở E. japonica (Wei và cộng sự, 2021). Ở L. vannamei, tiêm RPCH làm tăng đáng kể nồng độ Vg trong buồng trứng và huyết tương cũng như đường kính tế bào trứng, dẫn đến tác động tích cực đến sự phát triển của buồng trứng (Chen và cộng sự, 2018). Ở P. clarkii, RPCH thúc đẩy sự phát triển của buồng trứng bằng cách kích thích giải phóng GSH từ não và hạch ngực hoặc bằng cách tăng tốc tổng hợp MF ở cơ quan hàm dưới (Sarojini và cộng sự, 1995). RPCH có thể hoạt động như một hormone hạ lưu của chất dẫn truyền thần kinh 5-HT để thúc đẩy sự trưởng thành của tuyến sinh dục ở S. olivacea cái (Kornthong và cộng sự, 2013). Nghiên cứu này cho thấy rằng dsRNA RPCH thúc đẩy đáng kể biểu hiện VIH, cho thấy rằng việc im lặng RPCH ức chế quá trình sinh noãn hoàng bằng cách tăng cường biểu hiện VIH ở hạch cuống mắt ở S. paramamosain. Song song với đó, những kết quả này chứng minh rằng RPCH kích thích sự phát triển buồng trứng ở S. paramamosain bằng cách ức chế biểu hiện VIH ở hạch cuống mắt. Phương pháp truyền thống là loại bỏ VIH bằng cách cắt bỏ cuống mắt do đó thúc đẩy sự trưởng thành và sinh sản của buồng trứng ở S. paramamosain. Tuy nhiên, phương pháp này dẫn đến sự gia tăng tỷ lệ chết, giảm tỷ lệ sinh sản và tỷ lệ nở (Liu và cộng sự, 2018), do đó cần phát triển một phương pháp tiếp cận thay thế. Chu kỳ tổng hợp ngắn (khoảng 1 tuần), liều lượng thấp (chỉ 10 ng trên 1 g trọng lượng cơ thể) và chi phí tổng hợp peptide trưởng thành RPCH thấp khiến việc tiêm peptide tổng hợp RPCH trở thành một giải pháp thay thế đầy hứa hẹn cho việc cắt bỏ cuống mắt.

CHH thường tham gia vào quá trình điều hòa nhiều chức năng sinh lý khác nhau như nồng độ glucose trong máu và điều hòa thẩm thấu ở giáp xác (Liu và cộng sự, 2019; Chung và cộng sự, 2010). Việc làm im lặng CHH3 làm giảm nồng độ glucose trong máu ở S. paramamosain, cho thấy CHH3 chịu trách nhiệm điều hòa nồng độ glucose trong máu ở S. paramamosain (Liu và cộng sự, 2019). Trong nghiên cứu này, biểu hiện CHH3 được tăng cường đáng kể sau khi tiêm peptide trưởng thành RPCH trong 3, 6, 9 và 24 giờ. Ngược lại, biểu hiện CHH3 bị giảm đáng kể sau khi can thiệp vào RPCH và những kết quả này cho thấy RPCH có thể làm tăng nồng độ glucose trong máu của S. paramamosain bằng cách kích thích biểu hiện CHH3 ở hạch cuống mắt. Tương tự, nồng độ glucose lưu thông tăng đáng kể trong vòng 90 phút sau khi tiêm RPCH ở C. maenas (Alexander và cộng sự, 2018). Do đó, tác động mới của RPCH có thể là giải phóng CHH, gây ra tình trạng tăng đường huyết, tương tự như các kết quả trước đây đã báo cáo (Webster và cộng sự, 2012; Alexander và cộng sự, 2018). Đáng chú ý, CHH cũng tham gia vào quá trình điều hòa sự phát triển của buồng trứng (Wang và cộng sự, 2019), sinh sản (Tang và cộng sự, 2022; Zhou và cộng sự, 2019) và lột xác (Chung và cộng sự, 2010), cho thấy rằng RPCH có thể điều chỉnh các chức năng sinh lý của sự phát triển, sinh sản và lột xác của buồng trứng S. paramamosain bằng cách thúc đẩy biểu hiện CHH ở cuống mắt, phù hợp với các báo cáo trước đây (Zeng và cộng sự, 2016; Fu và cộng sự, 2016).

Ở giáp xác, MIH đóng vai trò thiết yếu trong quá trình lột xác chủ yếu bằng cách hạn chế sản xuất ecdysteroid (Lee và cộng sự, 2007; Zmora và cộng sự, 2009). Trong nghiên cứu này, biểu hiện MIH tăng đáng kể ở thời điểm 3, 6, 9 và 12 giờ sau khi tiêm RPCH và sự can thiệp vào RPCH làm giảm hiệu quả biểu hiện MIH ở hạch cuống mắt, cho thấy rằng sự biểu hiện quá mức RPCH có thể hạn chế quá trình lột xác ở S. paramamosain, trong khi việc loại bỏ RPCH sẽ đẩy nhanh quá trình lột xác. Những kết quả này chỉ ra rằng RPCH có thể hạn chế quá trình lột xác của S. paramamosain bằng cách điều chỉnh biểu hiện MIH ở hạch cuống mắt. Nghiên cứu này cung cấp bằng chứng đầu tiên cho thấy RPCH có thể tham gia vào quá trình lột xác của S. paramamosain bằng cách điều chỉnh biểu hiện MIH ở hạch cuống mắt. Như đã biết, quá trình lột xác theo chu kỳ ở giáp xác đi kèm với sự tăng trưởng và kích thước của S. paramamosain tăng lên sau mỗi lần lột xác, điều này rất có ý nghĩa đối với việc nuôi cấy S. paramamosain (Chen và cộng sự, 2021; Zhang và cộng sự, 2021). Do đó, nghiên cứu hiện tại cho thấy rằng việc can thiệp vào RPCH có thể góp phần kiểm soát sự tăng trưởng và lột xác trong quá trình nuôi cấy S. paramamosain. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng MIH cũng có vai trò quan trọng trong quá trình trưởng thành buồng trứng của các loài giáp xác trưởng thành, ví dụ, MIH góp phần vào quá trình sinh noãn hoàng bằng cách tăng cường biểu hiện và tiết Vg trong gan tụy ở C. sapidus (Zmora và cộng sự, 2009; Huang và cộng sự, 2015; Chung và cộng sự, 2010). Những kết quả này cho thấy RPCH có thể liên quan đến quá trình lột xác không chỉ bằng cách điều chỉnh biểu hiện MIH ở cuống mắt ở S. paramamosain, mà còn gián tiếp tham gia vào quá trình phát triển buồng trứng bằng cách điều chỉnh biểu hiện MIH ở S. paramamosain.

Dựa trên các nghiên cứu trên, chúng tôi đã xây dựng một cơ chế điều hòa tiềm năng của RPCH trên các neuropeptide họ CHH trong hạch cuống mắt S. paramamosain, tức là RPCH không chỉ thúc đẩy sự phát triển buồng trứng của S. paramamosain bằng cách tăng biểu hiện/tổng ​​hợp gen hạ lưu thông qua ức chế biểu hiện VIH trong hạch cuống mắt, mà còn điều hòa quá trình lột xác và mức glucose bằng cách điều chỉnh biểu hiện MIH và CHH trong hạch cuống mắt (Hình 9). Ngoài ra, RPCH cũng điều hòa sự phát triển buồng trứng của S. paramamosain bằng cách điều chỉnh biểu hiện MIH và CHH trong hạch cuống mắt (Hình 9). Tuy nhiên, cần có các nghiên cứu chức năng để xác minh các cơ chế cơ bản của RPCH trong S. paramamosain.

5. Kết luận

Nghiên cứu này lần đầu tiên cung cấp bằng chứng toàn diện cho thấy RPCH có liên quan đến quá trình trưởng thành buồng trứng, nồng độ glucose trong máu và chu kỳ lột xác ở S. paramamosain, thông qua việc điều hòa các neuropeptide thuộc họ CHH tại hạch cuống mắt. Đáng chú ý, kết quả nghiên cứu cho thấy sự phát triển buồng trứng của S. paramamosain có thể được thúc đẩy hiệu quả bằng phương pháp tiêm hoặc ủ peptide RPCH tổng hợp, qua đó cải thiện tỷ lệ sống, tỷ lệ nở và hiệu quả kinh tế. Những phát hiện này đề xuất một giải pháp thay thế an toàn cho phương pháp cắt bỏ cuống mắt vốn tiềm ẩn nguy cơ làm gia tăng tỷ lệ tử vong và làm suy giảm khả năng sinh sản cũng như tỷ lệ nở. Nhờ đó, nghiên cứu mở ra tiềm năng ứng dụng quan trọng trong sản xuất giống và nuôi thương phẩm S. paramamosain.

Theo Mei Wang, Jigui Yuan, Haihui Ye, Xiaohang Geng

Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352513424004836

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Bình Minh Capital

Xem thêm:

• Phân Tích Bệnh Phân Trắng (WFD) do Vibrio sp. Và Dinoflagellata Ở Tôm Thẻ Chân Trắng (Litopenaeus vannamei) Ở Ao Nuôi Nước Lợ
• Đâu Là Giải Pháp Thay Thế Khả Thi Cho Việc Cắt Bỏ Cuống Mắt Tôm?
• Ảnh Hưởng Của Việc Cho Ăn Trong Quá Trình Loại Bỏ Mùi Vị Khó Chịu Đến Sự Bài Tiết Geosmin Ở Cá Rô Phi