Kỹ Thuật Nuôi, Tin tức

Phần 1: Vi Bào Tử Trùng Enterocytozoon hepatopenaei Không Phải Là Nguyên Nhân Gây Ra Hội Chứng Phân Trắng Ở Tôm Thẻ Chân Trắng Penaeus (Litopenaeus) vannamei

Tóm tắt

Giới thiệu

Vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei lần đầu được phát hiện tại Thái Lan vào năm 2009 trên tôm sú nuôi (Penaeus (Penaeus) monodon). Cho đến nay, vật chủ tự nhiên của loài ký sinh trùng này vẫn chưa được xác định. Gần đây, một vi bào tử trùng có đặc điểm hình thái và ái lực mô tương tự đã được phát hiện trên tôm thẻ chân trắng nuôi (Penaeus (Litopenaeus) vannamei) tại Thái Lan, có biểu hiện hội chứng phân trắng (WFS). Mục tiêu của nghiên cứu này là so sánh tác nhân gây bệnh mới phát hiện với E. hepatopenaei và đánh giá mối quan hệ nhân quả giữa tác nhân này và WFS.

Kết quả

Việc sử dụng các cặp mồi phổ biến để khuếch đại, nhân bản và giải trình tự một đoạn gen RNA ribosome tiểu đơn vị nhỏ (ssu rRNA) cho thấy vi bào tử trùng được phát hiện trong các ao nuôi có WFS có mức độ tương đồng trình tự lên đến 99% so với E. hepatopenaei, chứng tỏ đây là cùng một loài. Phân tích mô học thông thường bằng các lát cắt nhuộm hematoxylin–eosin (H&E) cho thấy chỉ một số ít tế bào biểu mô ống có chứa bào tử, gợi ý mức độ nhiễm nhẹ. Tuy nhiên, kết quả H&E này mang tính đánh giá chưa đầy đủ, bởi các phân tích PCR lồng nhau và lai tại chỗ (in situ hybridization) dựa trên đoạn gen ssu rRNA đã nhân bản cho thấy mức độ nhiễm rất nặng tại các tế bào biểu mô ống ở vùng trung tâm của gan tụy, ngay cả khi không quan sát thấy bào tử.

Mặc dù vậy, tỷ lệ nhiễm E. hepatopenaei cao được ghi nhận ở tôm thu từ các ao không xuất hiện WFS cũng như các ao đã phục hồi sau WFS cho thấy không tồn tại mối liên hệ trực tiếp giữa sự nhiễm vi bào tử trùng này và hội chứng phân trắng. Kết luận này được củng cố thêm bởi các thí nghiệm cảm nhiễm qua đường miệng trong phòng thí nghiệm, trong đó cho thấy sự lây truyền ngang trực tiếp sang tôm khỏe nhưng không ghi nhận bất kỳ dấu hiệu WFS nào.

Kết luận

Vi bào tử trùng được phát hiện trên P. vannamei là cùng loài với E. hepatopenaei đã được mô tả trước đó và không có mối liên quan trực tiếp đến hội chứng phân trắng. Tuy nhiên, mức độ nhiễm nghiêm trọng của ký sinh trùng này cao hơn đáng kể so với các báo cáo trước đây trên P. monodon chắc chắn sẽ ảnh hưởng tiêu cực đến tăng trưởng và hiệu quả sản xuất của tôm thẻ chân trắng. Tác động này có thể trở nên trầm trọng hơn do khả năng lây truyền ngang, đã được chứng minh thông qua các thử nghiệm cảm nhiễm trong phòng thí nghiệm. Do đó, nghiên cứu khuyến nghị áp dụng các phương pháp PCR và lai in situ được phát triển trong nghiên cứu này nhằm xác định các vật chủ chứa tự nhiên, từ đó có thể loại bỏ chúng khỏi hệ thống nuôi tôm.

Giới thiệu

Một số loài vi bào tử trùng đã được ghi nhận là tác nhân gây bệnh trên tôm thuộc họ Penaeidae. Trong nghiên cứu này, hai loài đã được báo cáo là gây nhiễm cho tôm nuôi tại Thái Lan. Trong đó, loài Agmasoma (trước đây được gọi là Thelohania) được xác định là ký sinh trên mô cơ và mô liên kết của tôm sú Penaeus (Penaeus) monodon và tôm Penaeus (Feneropenaeus) merguiensis. Về mặt hình thái học, loài này tương đồng với Agmasoma penaei, vốn đã được báo cáo gây nhiễm trên Penaeus (Litopenaeus) setiferus và Penaeus (Farfantepenaeus) duorarum tại châu Mỹ. Gần đây, tại Thái Lan cũng đã ghi nhận sự nhiễm loài vi bào tử trùng này trên cùng loại mô ở tôm thẻ chân trắng Penaeus (Litopenaeus) vannamei. Ngoài ra, bào tử của một loài vi bào tử trùng chưa được định danh cũng đã được phát hiện trong mô cơ của P. monodon tại Madagascar.

Một loài vi bào tử trùng khác được báo cáo tại Thái Lan là Enterocytozoon hepatopenaei, một loài mới được mô tả, ký sinh chủ yếu trong các tế bào biểu mô ống của gan tụy tôm sú P. monodon. Năm 2010, E. hepatopenaei cũng đã được phát hiện ở P. monodon biểu hiện hội chứng phân trắng (WFS) tại Việt Nam. Trong nghiên cứu này, chúng tôi ghi nhận các trường hợp nhiễm lan rộng của E. hepatopenaei trên tôm thẻ chân trắng P. vannamei nuôi tại Thái Lan, có biểu hiện WFS. Bên cạnh đó, kỹ thuật PCR lồng nhau (nested PCR) được sử dụng để kiểm tra tôm thẻ chân trắng thu từ ao nuôi cũng như trong các thí nghiệm cảm nhiễm qua đường miệng, sử dụng mô gan tụy từ tôm bị nhiễm vi bào tử trùng.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn mẫu tôm nuôi WFS và tôm nuôi bình thường

Vì Nguyên tắc và Hướng dẫn Đạo đức về Sử dụng Động vật của Hội đồng Nghiên cứu Quốc gia Thái Lan (1999) chỉ áp dụng cho động vật có xương sống và không có tiêu chuẩn chính thức nào cho động vật không xương sống, nên chúng tôi đã điều chỉnh các nguyên tắc của nó cho tôm. Chúng tôi cũng tuân thủ các hướng dẫn của chính quyền tiểu bang New South Wales, Úc về việc thu hoạch cá và giáp xác một cách nhân đạo (http://www.dpi.nsw.gov.au/agriculture/livestock/animal-welfare/general/fish/shellfish ; ngày 30 tháng 3 năm 2013) liên quan đến các chi tiết về vận chuyển tôm và bảo quản trong phòng thí nghiệm. Đối với việc xử lý tôm để phân tích mô học hoặc để tiêu hủy vào cuối thí nghiệm, phương pháp sử dụng nước muối/bùn đá được khuyến nghị trong các hướng dẫn của Úc.

Một bộ mẫu tôm được thu thập từ tỉnh Surathani ở miền nam Thái Lan vào ngày 28 tháng 10 năm 2010 và bao gồm tôm từ 2 ao biểu hiện WFS, 1 ao phục hồi từ WFS và 2 ao bình thường. Sau khi gây mê, tôm được lau bằng cồn 70% và loại bỏ vỏ để khoảng 100 mg mô gan tụy bên ngoài (không bao gồm ô nhiễm từ phần bên trong của dạ dày và ruột giữa) có thể được chuyển vô trùng vào đệm chiết xuất DNA (xem bên dưới). Phần còn lại của toàn bộ gan tụy (bao gồm manh tràng ruột giữa trước, khoang sau của dạ dày và một phần ruột giữa) được tiêm chất cố định Davidson và xử lý để phân tích mô học như đã mô tả trước đây. Một bộ mẫu tôm thẻ chân trắng P. vannamei non thứ hai biểu hiện hội chứng phân trắng được thu thập từ một trang trại nuôi tôm thâm canh ở tỉnh Chanthaburi, Thái Lan trong tháng 8 – tháng 9 năm 2011 cùng với tôm bình thường từ một ao gần đó. Một số trong những con tôm này đã được xử lý để chiết xuất DNA từ mô gan tụy như mô tả ở trên trong khi số còn lại được sử dụng trong các thử nghiệm về sự lây truyền của vi bào tử trùng bằng cách cho ăn mô gan tụy bị nhiễm bệnh vào tôm bình thường.

Chuẩn bị khuôn mẫu DNA

Mô gan tụy được đồng nhất trong đệm ly giải (50 mM Tris–HCl, pH 8,0, 50 mM EDTA, 1% SDS, 10 mM NaCl) chứa 5 μg/ml proteinase K. DNA bộ gen được phân lập và tinh chế bằng phương pháp phenol-chloroform và nồng độ được xác định bằng cách đo độ hấp thụ UV ở 260 nm. Tất cả các khuôn mẫu DNA đã được điều chỉnh đến nồng độ 50 ng/μl bằng nước cất để thử nghiệm PCR.

Nhân bản một đoạn gen RNA ribosome tiểu đơn vị nhỏ của vi bào tử trùng

Một đoạn gen ssu rRNA của vi bào tử trùng đã được khuếch đại từ WFS P. vannamei bằng PCR như đã mô tả trước đây. Tóm lại, các đoạn mồi MF1 và MR1 (Bảng 1) được thiết kế từ một đoạn ssu rRNA của Enterocytozoon hepatopenaei được phân lập từ P. monodon và tương ứng với các vị trí 242–260 và 1165–1183 của hồ sơ Genbank FJ496356. Quá trình PCR được thực hiện trong hỗn hợp phản ứng 25 μl chứa đệm PCR, 0,2 mM dNTP, 1,5 mM MgCl2, 0,1 μM đoạn mồi, 0,625 đơn vị Taq DNA polymerase (Invitrogen) và 1 μl khuôn mẫu. Phân tích PCR bao gồm 35 chu kỳ biến tính ở 94°C trong 20 giây, ủ ở 64°C trong 20 giây và kéo dài ở 72°C trong 45 giây, sau đó kéo dài cuối cùng trong 5 phút ở 72°C. Một đoạn gen srRNA dài 900 – 1.000 bp đã được khuếch đại và nhân bản bằng Bộ dụng cụ nhân bản pGEMT-easy (Promega). Plasmid được chiết xuất từ ​​ba bản sao, tinh chế bằng bộ dụng cụ chiết xuất plasmid (Geneaid) và giải trình tự theo cả hai hướng bằng hai mồi vectơ phổ quát, SP6 và T7, của Macrogen, Hàn Quốc. Trình tự đồng thuận thu được (trừ các mồi) đã được tiến hành tìm kiếm BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) trên cơ sở dữ liệu GenBank và sau đó được căn chỉnh với vùng tương ứng của trình tự ssu rRNA của E. hepatopenaei (Genbank: FJ496356) bằng Clustal-W2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ ). Trong số ba trình tự bản sao, hai trình tự giống hệt nhau 100%, trong khi một trình tự khác nhau ở 2/951 bazơ được phân tích. Bản sao có tên MF12 được sử dụng làm khuôn mẫu kiểm soát dương tính cho phản ứng PCR.

Bảng 1 Trình tự mồi được sử dụng
Bảng 1 Trình tự mồi được sử dụng

Để xác minh hồ sơ GenBank FJ496356 cho trình tự ssu rRNA của vi bào tử trùng E. hepatopenaei từ P. monodon, chúng tôi đã sử dụng cùng một phân tích PCR được mô tả ở trên để khuếch đại lại và sao chép lại đoạn gen ssu rRNA từ DNA lưu trữ được sử dụng làm khuôn mẫu tạo ra hồ sơ FJ496356. Bản sao được sao chép và 3 bản sao được giải trình tự để có được trình tự đồng thuận.

Phát hiện PCR nhiễm vi bào tử trùng ở P. vannamei

Hai cặp mồi đặc hiệu, ENF779/ ENR779 và ENF176/ ENR176 được thiết kế từ bản sao được mô tả ở trên cho phân tích PCR lồng nhau để tăng cường độ đặc hiệu và độ nhạy để phát hiện vi bào tử trùng mới (Bảng 1). Phản ứng khuếch đại PCR được thực hiện trong hỗn hợp phản ứng 25 μl chứa 200 mM dNTP, 1,5 mM MgCl2, 0,1 mM mồi và 0,625 đơn vị Taq polymerase (Invitrogen). Đối với phản ứng PCR bước đầu tiên, phân tích bao gồm biến tính ban đầu ở 94°C trong 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ biến tính ở 94°C trong 20 giây, ủ ở 58°C trong 20 giây và kéo dài ở 72°C trong 45 giây với lần kéo dài cuối cùng ở 72°C trong 5 phút. Phản ứng PCR lồng nhau thứ hai được thực hiện bằng cách sử dụng 1 μl sản phẩm PCR đầu tiên làm khuôn mẫu. Các điều kiện phản ứng PCR bao gồm biến tính ban đầu ở 94°C trong 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ biến tính ở 94°C trong 20 giây, ủ ở 64°C trong 20 giây và kéo dài ở 72°C trong 20 giây với một lần kéo dài bổ sung ở 72°C trong 5 phút. Các sản phẩm PCR được hình dung bằng điện di gel agarose 1,5%, nhuộm ethidium bromide và đặt gel trên máy chiếu tia cực tím. Để xác định độ nhạy phát hiện, pha loãng nối tiếp 10 lần (106 – 1 bản sao plasmid) đã được chuẩn bị và tiến hành theo phân tích PCR lồng nhau.

Phân tích lai In situ

Bộ dụng cụ đánh dấu Dig-PCR (Roche, Đức) đã được sử dụng để chuẩn bị một đầu dò cho lai tại chỗ bằng cách sử dụng các đoạn mồi được hiển thị trong Bảng 1. Một đầu dò GFP-Dig được đánh dấu tương tự đã được sử dụng làm đối chứng âm tính. Các dòng plasmid MF12 và pEGFP–N1 (Clontech) chứa các đoạn chèn có liên quan được sử dụng làm khuôn mẫu cho Enterocytozoon sp. và đối chứng âm tính tương ứng. Các đầu dò được gắn nhãn Dig được tinh chế bằng bộ dụng cụ tinh chế PCR (Geneaid) và hiệu quả gắn nhãn được xác định bằng phương pháp lai chấm. Tôm được cố định trong dung dịch cố định Davidson qua đêm trước khi xử lý để nhúng parafin thông thường. Các phần mô được tiêu hóa bằng 10 μg/ml Proteinase K (Invitrogen, Hoa Kỳ) trong đệm TNE trong 10 phút ở 37°C. Mỗi phần được phủ 200 μl dung dịch lai hóa trước [4 × SSC và 50% (v/v) formamid khử ion] và ủ ở 37°C trong 30 phút trước khi dung dịch được thay thế bằng 200 μl hỗn hợp lai hóa có chứa đầu dò gắn nhãn DIG (khoảng 20 ng/ phiến kính) và phủ bằng một tấm kính. Phản ứng lai hóa được thực hiện ở 42°C trong 20 giờ trong buồng ẩm để tránh bay hơi. Sau khi rửa các phần bằng độ nghiêm ngặt cao, chúng được ủ với dung dịch chặn 0,5% (Roche, Đức) trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Các phần được ủ với kháng thể anti-digoxigenin liên hợp với phosphatase kiềm (pha loãng 1:500). Kháng thể không liên kết được rửa sạch hai lần và cân bằng trong dung dịch đệm phát hiện (100 mM Tris–HCl, 100 mM NaCl và 50 mM MgCl2, pH 9,5). Tín hiệu được phát triển bằng cách thêm chất nền NBT-BCIP (Roche, Đức) và nhuộm màu tương phản được thực hiện bằng Bismarck brown Y (Sigma, Hoa Kỳ). Các tiêu bản được quan sát và chụp ảnh bằng kính hiển vi Olympus có máy ảnh kỹ thuật số.

Thử nghiệm cảm nhiễm trong phòng thí nghiệm

Tôm thẻ trắng nặng 6–8 gam được lấy từ một trang trại ở tỉnh Chanthaburi, Thái Lan và được nuôi tại Phòng thí nghiệm Trung tâm nghiên cứu kinh doanh nuôi trồng thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Kasetsart trong 1 tuần. Trong thời gian nuôi thích nghi, tôm được cho ăn thức ăn viên thương mại. Sau đó, 60 con tôm được thả ngẫu nhiên vào 6 bể nuôi (mỗi bể 80 lít) với 10 con tôm mỗi bể. Tôm được chia thành 2 nhóm, mỗi nhóm 30 con (tức là 3 bể nuôi). Tôm từ nghiệm thức được cho ăn mô gan tụy của tôm bị nhiễm E. hepatopenaei mỗi ngày trong 7 ngày (một lần một ngày và một bữa ăn khác được cho ăn thức ăn viên thương mại) trong khi tôm từ nhóm đối chứng được cho ăn thức ăn viên thương mại hai lần một ngày. Oxy hòa tan (DO), Độ mặn, pH và nhiệt độ trong thời gian thích nghi và thí nghiệm được duy trì ở mức 4 ppm, 25 ppt, 7,8–8,0 và 28°C. Thử nghiệm đã kết thúc sau 7 ngày. Tôm được lấy mẫu (một con từ mỗi bể nuôi) vào ngày 2, 4 và 7 sau khi cho ăn để thử nghiệm PCR bằng cách sử dụng mồi E. hepatopenaei. Chúng cũng được theo dõi tỷ lệ chết và các dấu hiệu của WFS.

..Còn tiếp…

Theo Amornrat Tangprasittipap, Jiraporn Srisala, Saisunee Chouwdee, Montagan Somboon, Niti Chuchird, Chalor Limsuwan, Thinnarat Srisuvan, Timothy W Flegel và Kallaya Sritunyalucksana

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Bình Minh Capital

Xem thêm:

You cannot copy content of this page