English
Kỹ Thuật Nuôi, Tin tức
Phần 1: Đánh Giá Vai Trò Của Việc Bổ Sung Tryptophan Trong Việc Tăng Trưởng, Giảm Hành Vi Hung Hăng Và Tăng Cường Khả Năng Miễn Dịch Ở Cua Con Scylla paramamosain
Tóm tắt
Nghiên cứu này nhằm xác định mức tryptophan (Trp) trong khẩu phần ăn tối ưu cho cua bùn Scylla paramamosain và đánh giá tác động lên sự tăng trưởng, hành vi hung hăng và khả năng miễn dịch. Qua thử nghiệm cho ăn trong 56 ngày với 5 khẩu phần ăn có mức Trp lần lượt là 2,94, 3,38, 3,68, 4,05 và 4,39 g Trp/kg thức ăn (khẩu phần ăn khô) cho thấy khi bổ sung 3,68 g Trp/kg đã tối đa hóa sự tăng trưởng và làm tăng đáng kể hàm lượng protein, mức axit amin thơm, hoạt động của enzyme tiêu hóa và biểu hiện của các gen liên quan đến tổng hợp protein (Tor và S6k1) (P < 0,05). Khẩu phần ăn có 4,05 g Trp/kg làm giảm hành vi hung hăng (P < 0,05), dẫn đến tăng mức serotonin (P < 0,05), cho thấy Trp có thể được chuyển hóa thành serotonin trong cơ thể sống để ngăn chặn hành vi hung hăng. Mặc dù Trp có vai trò quan trọng trong tăng trưởng, nhưng việc bổ sung quá nhiều (trên 4,05 g/kg) lại làm giảm hoạt tính của các enzyme miễn dịch như trypsin và lysozyme, tiềm ẩn nguy cơ gây hại cho sức khỏe của cua con. Phân tích hồi quy đa thức bậc hai, sử dụng dữ liệu về tỷ lệ tăng trọng (WGR) và tỷ lệ tăng trưởng riêng (SGR), cho thấy phạm vi bổ sung Trp trong khẩu phần ăn tối ưu là 3,94–3,98 g/kg đối với S. paramamosain non. Những kết quả này cung cấp thông tin chi tiết có giá trị để xây dựng khẩu phần ăn trong nuôi trồng thủy sản giáp xác, có thể cải thiện hiệu suất tăng trưởng và hỗ trợ phúc lợi động vật của cua bùn.
1. Giới thiệu
Các axit amin chức năng đang là tâm điểm của các nghiên cứu gần đây nhờ vào vai trò đa dạng và quan trọng của chúng trong các quá trình sinh học (Takagi, 2019; Ren và cộng sự, 2020). Các axit amin này không chỉ bao gồm các axit amin thiết yếu mà còn bao gồm một số axit amin không thiết yếu (Ren và cộng sự, 2020). Các axit amin chức năng phát huy tác dụng sinh học bằng cách tham gia vào các con đường chuyển hóa cụ thể, bao gồm điều chỉnh hệ thống miễn dịch, tăng cường sức khỏe đường ruột và thúc đẩy quá trình dị hóa và đồng hóa protein của động vật thủy sinh (Wu, 2010; Hoseini và cộng sự, 2019).
Tryptophan (Trp) là một axit amin thiết yếu và là một axit amin chức năng quan trọng, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tăng trưởng, ăn uống, miễn dịch và hành vi của động vật thủy sinh (Cerqueira và cộng sự, 2020). Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc bổ sung Trp đầy đủ có thể cải thiện đáng kể tỷ lệ sống và tăng trọng của tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei (Sun và cộng sự, 2016), cá tráp mõm Megalobrama amblycephala (Ji và cộng sự, 2019) và cá trắm cỏ non Ctenopharyngodon idellus (Wen và cộng sự, 2014). Ngoài ra, Trp thúc đẩy quá trình tổng hợp protein bằng cách tăng biểu hiện của các gen chính trong con đường truyền tín hiệu TOR, điều chỉnh quá trình tổng hợp protein để đáp ứng với tình trạng sẵn có của axit amin và các yếu tố khác, do đó hỗ trợ sự tăng trưởng và chức năng tế bào (Bond, 2016). Ngoài ra, mức khẩu phần ăn Trp tối ưu làm tăng đáng kể hoạt động của enzyme chống oxy hóa, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương oxy hóa bằng cách trung hòa các loại oxy phản ứng (ROS) ở động vật thủy sinh (Wang, 2013; Qiu và cộng sự, 2015; Xu, 2018). Hơn nữa, Trp đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh phản ứng miễn dịch của giáp xác (Huang và cộng sự, 2020), cho thấy sự biểu hiện cao của các gen liên quan đến miễn dịch bao gồm yếu tố giống NF-kappa-B Relish (Relish) (Sun và cộng sự, 2022) và Lysozyme (Ferraboschi và cộng sự, 2021). Việc tăng cường hoạt động của enzyme chống oxy hóa và các gen liên quan đến miễn dịch giúp tăng cường khả năng chịu đựng căng thẳng và chống lại bệnh tật của cơ thể (Mates và cộng sự, 1999). Do đó, cần việc xác định nhu cầu Trp tối ưu để thúc đẩy tăng trưởng khỏe mạnh, khả năng miễn dịch và cải thiện hiệu quả sinh sản của động vật thủy sản.
Hành vi hung hăng rất phổ biến trong nuôi trồng thủy sản, gây ảnh hưởng đáng kể đến cả năng suất và phúc lợi của các sinh vật nuôi (Albalat và cộng sự, 2022). Các cuộc xung đột giữa các cá thể có thể dẫn đến tổn thương vật lý, làm giảm tỷ lệ sống và tốc độ tăng trưởng, đồng thời gia tăng nguy cơ lây lan bệnh tật (Albalat và cộng sự, 2022; Romano và Zeng, 2017). Vai trò ức chế của Trp trong khẩu phần ăn đối với hành vi hung hăng đã được ghi nhận ở nhiều loài thủy sinh khác nhau (Hoglund và cộng sự, 2005; Winberg và cộng sự, 2001; Harlıoglu và cộng sự, 2014; Sneddon và cộng sự, 2000), đặc biệt là ở các loài giáp xác như cua đồng Trung Quốc Eriochier sinensis (Pang và cộng sự, 2024) và cua bùn Scylla serrata (Laranja và cộng sự, 2010). Trp là tiền chất của serotonin (5-HT), tương tác với thụ thể 5-Hydroxytryptamine 1 (5-HTR1) để điều chỉnh tín hiệu nội bào và giảm giải phóng chất dẫn truyền thần kinh, từ đó ức chế hành vi hung hăng (Siegel và cộng sự, 2007). Làm rõ nhu cầu về Trp cũng như cơ chế mà Trp ảnh hưởng đến hành vi hung hăng có thể giúp cải thiện phúc lợi động vật và tăng hiệu quả sản xuất của động vật thủy sinh.
Scylla paramamosain, một thành viên của họ Portunidae và chi Scylla, là một loài giáp xác phân bố chủ yếu dọc theo các vùng ven biển đông nam của Trung Quốc. (Wu và cộng sự, 2024). S. paramamosain được công nhận là một trong bốn loài cua chính ở Trung Quốc, do tốc độ tăng trưởng nhanh, thời gian nuôi ngắn và giá trị kinh tế đáng kể, quy mô và sản lượng nuôi S. paramamosain đã tăng liên tục trong hai mươi năm qua (Li và cộng sự, 2018), với sản lượng hàng năm đạt 154.600 tấn theo báo cáo năm 2022 (Niên giám thống kê nghành nuôi trồng thủy sản Trung Quốc, 2023). Những tiến bộ trong kỹ thuật nuôi trồng thủy sản đã dẫn đến sự mở rộng đáng kể của ngành nuôi cua. Trong khi đó, nghiên cứu đang được tiến hành sâu hơn vào nhu cầu dinh dưỡng của axit amin chức năng đối với S. paramamosain (Wu và cộng sự, 2024, 2022). Tuy nhiên, bản chất hung hăng của S. paramamosain dẫn đến tỷ lệ chết, thương tích cao hơn và tác động tiêu cực đến sự tăng trưởng và năng suất chung của S. paramamosain (Romano và Zeng, 2017). Do đó, cần phải áp dụng một chiến lược quản lý phù hợp để giảm thiểu tác động của hành vi hung hăng của cua. Nghiên cứu này nhằm xác định lượng Trp cần thiết để thúc đẩy tăng trưởng và phản ứng miễn dịch của S. paramamosain, đồng thời giảm thiểu tác động của hành vi hung hăng. Dự kiến sẽ cung cấp cơ sở khoa học để phát triển thức ăn cua chất lượng cao nhằm thúc đẩy tăng trưởng và giảm ăn thịt đồng loại.
2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Khẩu phần ăn
Năm khẩu phần ăn isonitrogenous (45%) và iso-lipidic (11%) đã được xây dựng, với mức Trp lần lượt là 2,94, 3,38, 3,68, 4,05 và 4,39 g/kg (trọng lượng khô) (Sun và cộng sự, 2015; Jin và cộng sự, 2017). Bột cá và casein được sử dụng làm nguồn protein hoàn chỉnh, alanine được bổ sung để duy trì isonitrogenous của khẩu phần ăn (Bảng 1). Hỗn hợp axit amin trong thức ăn được xây dựng dựa trên thành phần axit amin của S. paramamosain (Wu và cộng sự, 2022, 2024). Hàm lượng axit amin chi tiết được trình bày trong Bảng 2. Các thành phần được xử lý thành bột mịn (<125 μm) bằng máy nghiền siêu nhỏ (WFS-8, Jiangsu Hongda Powder Equipment Co., Ltd., Trung Quốc). Hỗn hợp axit amin kết tinh được phủ carboxymethyl cellulose (CMC) và trộn đều trong máy khuấy (Alam và cộng sự, 2005). Sau đó, lipid và nước cất được đưa vào hỗn hợp khô để tạo thành bột đồng nhất. Bột được đùn thành các hạt 0,8 mm bằng máy đùn trục vít đôi (G-250, Đại học Công nghệ Nam Trung Quốc, Quảng Châu, Trung Quốc). Các hạt được hấp ở 45℃ trong 1 giờ và sấy khô trong không khí đến khối lượng không đổi. Sau đó, thức ăn được bảo quản trong điều kiện kín ở nhiệt độ – 20℃.
a. Mua từ Trident Seafoods Corporation, Seattle, Hoa Kỳ.
b. Hỗn hợp axit amin, hỗn hợp g/kg: Isoleucine, 8,2; Leucine, 17,2; Arginine, 33,5; Methionine, 12,1; Phenylalanine, 8,7; Threonine, 10,8; tryptophan, 2,6; Valine, 9,4; Axit aspartic, 30,2; Axit glutamic, 36,3; Serine, 8,7; Proline, 1,9; Glycine, 33,8; Alanine, 22,7; Tyrosine, 9,5; cysteine, 6,5.
c. Hỗn hợp vitamin, hỗn hợp g/kg: thiamine B1, 5,0; riboflavin, 8,0; nicotinamide, 26,0; biotin, 1,0; canxi pantothenat, 15,0; vitamin B6, 3,0; axit folic, vitamin B9, 5,0; vitamin C, 121,0; vitamin K, 2,02; axit p-aminobenzoic, 3,0; vitamin B12, 1,0; xenluloza, 529,0; vitamin A, 25,0; vitamin D3, 25,0; vitamin E, 50,0; inositol, 181,0.
d . Hỗn hợp khoáng chất, hỗn hợp g/kg: canxi dihydro phosphat, 122,87; lactat, 474,22; natri dihydro phosphat, 42,03; kali persulfat, 163,83; sắt (II) sulfat, 10,78; sắt citrat, 38,26; magiê sulfat, 44,19; kẽm sulfat, 4,74; mangan sulfat, 0,33; đồng sunfat, 0,22; coban clorua, 0,43; iodat, 0,02; natri clorua, 32,33; kali clorua, 65,75.
Lưu ý: Giá trị trung bình ± Độ lệch chuẩn, n = 3; Trp: Tryptophan; Thr: Threonine; Val: Valine; Ile: Isoleucine; Leu: Leucine; Phe: Phenylalanine; Lys: Lysine; His: Histidine; Arg: Arginine; Met: Methionine; Asp: Axit aspartic; Ser: Serine; Glu: Axit glutamic; Pro: Proline; Gly: Glycine; Ala: Alanine; Cys: Cysteine; Tyr: Tyrosine.
2.2. Động vật
Cua con được lấy từ một trại giống thương mại ở Taizhou, Trung Quốc. Sau thời gian thích nghi kéo dài một tuần trong điều kiện phòng thí nghiệm, 300 con cua có kích thước đồng đều (29,31 ± 6,13 mg) với các chi còn nguyên vẹn đã được chọn. Những con cua này được phân bổ ngẫu nhiên vào các thùng chứa 250 ml riêng lẻ và mỗi khẩu phần ăn được thiết lập ba lần lặp lại (20 con cua cho mỗi lần lặp lại). Một thí nghiệm trong nhà kéo dài 8 tuần đã được tiến hành, với các lần cho ăn hàng ngày được lên lịch vào lúc 9:30 sáng và 4:30 chiều. Thức ăn còn lại được loại bỏ và nước được thay hoàn toàn sau một giờ cho ăn. Quá trình lột xác và tỷ lệ chết hàng ngày đã được ghi lại. Nhiệt độ nước được duy trì trong khoảng từ 27 đến 29℃, độ mặn được giữ ở mức 27–28 g/L, oxy hòa tan luôn ở mức trên 6 mg/L và mức nitơ amoniac được giữ dưới 0,05 mg/L.
2.3. Thu thập mẫu và tính toán thông số tăng trưởng
Trước khi bắt đầu thí nghiệm, 60 con cua từ mỗi nghiệm thức được cân để ghi lại trọng lượng cơ thể ban đầu. Trước khi kết thúc thí nghiệm nuôi, cua con được nhịn ăn trong 24 giờ. Sau thí nghiệm nuôi, trọng lượng cơ thể cuối cùng của cua được ghi lại bằng cân điện tử (độ chính xác 0,001 g). Sau đó, các mẫu vật được đông lạnh nhanh trong nitơ lỏng và bảo quản ở nhiệt độ -80℃ để phân tích tiếp theo. Các thông số tăng trưởng được tính theo các công thức sau (Wu và cộng sự, 2024):
Trọng lượng cơ thể ban đầu (IBW, g/ cua);
Trọng lượng cơ thể cuối (FBW, g/ cua);
Tỷ lệ tăng trọng (WGR, %) = 100 × (FBW – IBW) / IBW;
Tỷ lệ tăng trưởng riêng (SGR, %/ ngày) = 100 × (ln (FBW) – ln (IBW)) / ngày;
Tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR, g/ g) = lượng thức ăn khô tiêu thụ / tăng trọng ướt;
Tần suất lột xác (MF) = (Σ thời gian lột xác của mỗi con cua sống sót) / lượng cua cuối cùng;
Tỷ lệ sống (%) = 100 × (lượng cua cuối cùng) / (lượng cua ban đầu).
2.4. Phân tích thành phần sinh hóa
Các mẫu cua nguyên con được sấy khô đến trọng lượng không đổi bằng máy sấy đông lạnh (LL1500, Thermo, Waltham, Hoa Kỳ; − 110℃) hoặc lò nướng (105℃) để xác định hàm lượng ẩm của cả cua nguyên con và thức ăn. Theo AOAC (1995), protein thô (tổng nitơ) được đo bằng máy phân tích nitơ Kjeldahl (K355/K437, Buchi, Flawil, Thụy Sĩ), chất béo thô được xác định bằng thiết bị chiết Soxhlet (E816, Buchi, Flawil, Thụy Sĩ) và hàm lượng tro được đánh giá bằng lò nung ở 550℃.
Thành phần axit amin của thức ăn và cua nguyên con được phân tích bằng máy phân tích tự động (L-8900, Hitachi, Tokyo, Nhật Bản). Các mẫu đồng nhất đầu tiên được thủy phân trong dung dịch HCl 6,0 M ở 110℃ trong 24 giờ trong môi trường nitơ. Nhận dạng và số lượng axit amin được đánh giá bằng cách tham khảo thời gian lưu và diện tích đỉnh của axit amin chuẩn (Sigma-Aldrich, St. Louis. MO, Hoa Kỳ)
2.5. Xác định hoạt động của enzyme và các thông số chống oxy hóa
Các mẫu cua nguyên con được nghiền thành bột bằng cối gốm và trộn với nước muối đã làm lạnh trước theo tỷ lệ 1:9 (w:v) để tạo thành hỗn hợp đồng nhất. Sau đó, hỗn hợp đồng nhất được ly tâm ở tốc độ 2500 vòng/phút trong 10 phút ở 4℃ bằng máy ly tâm đông lạnh (Fresco17, Thermo Scientific, Waltham, Hoa Kỳ) để tách phần dịch nổi để phân tích tiếp theo. Tổng lượng protein được xác định bằng albumin huyết thanh bò làm chuẩn (Bradford, 1976).
Hoạt động của enzyme, bao gồm enzyme tiêu hóa (amylase (C016–2–1), trypsin (A080–2–1) và lipase (A054–2–1)), các thông số chống oxy hóa (malondialdehyde (MDA, A003–1–2), superoxide dismutase (SOD, A001–3–2), catalase (CAT, A007–1–1)), cũng như phosphatase axit (ACP, A060–2–1) và phosphatase kiềm (AKP, A059–2–2) đều được đo bằng bộ dụng cụ thương mại (Viện Kỹ thuật sinh học Tấn Thành Nam Kinh, Nam Kinh, Trung Quốc), theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Serotonin (5-HT, ml874512), melatonin (MLT, ml025846), tryptophan hydroxylase (TPH, ml037506) và histone acetyltransferase (HAT, HZ68932 MLBIO) được đo bằng bộ dụng cụ Elisa (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., LTD, Trung Quốc), theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.6. Biểu hiện gen
Phân tích biểu hiện gen được tiến hành bằng cách chiết xuất RNA từ toàn bộ cua bằng thuốc thử Trizol (Invitrogen CA, Hoa Kỳ). Nồng độ và độ tinh khiết của tổng RNA được xác định bằng máy quang phổ NanoDrop 2000 và điều chỉnh đến 500 ng/µl. cDNA thu được thông qua phiên mã ngược của tổng RNA bằng Bộ thuốc thử PrimeScript RT (Takara, Đại Liên, Trung Quốc). Các đoạn mồi Target of rapamycin (Tor), Ribosome protein S6 kinase beta-1 (S6k1), NF-kappa-B-like factor Relish (Relish), Lysozyme và 5-hydroxytryptamine receptor 1 (5-HTR1) được tổng hợp bởi Sangon Biotech Co. Ltd. Trung Quốc. Và trình tự của các đoạn mồi được thể hiện trong Bảng 3. Hệ thống PCR thời gian thực QuantStudio™ 6 Flex (Life Technologies, CA, Hoa Kỳ) được sử dụng cho qPCR. Tính toán biểu hiện gen tương đối được thực hiện theo Livak và Schmittgen (2001), với beta-actin đóng vai trò là đối chứng nội bộ.
Lưu ý:
a Tor: Target of rapamycin.
b S6k1: Ribosomal protein S6 kinase beta-1.
c 5-HTR1: 5-hydroxytryptamine receptor 1.
d Relish: NF-kappa-B-like factor Relish
2.7. Đánh giá hành vi hung hăng
Trong giai đoạn giữa (tuần thứ 4) và giai đoạn cuối (tuần thứ 8) của thí nghiệm, 10 cặp cua con có trọng lượng cơ thể tương đương ở mỗi nghiệm thức được cho vào một hộp đựng 250 ml sau thời gian nhịn ăn 6 giờ. Hành vi của chúng được ghi lại trong một giờ bằng máy ảnh có độ phân giải cao (EOS R7, Canon, Nhật Bản) và sau đó được đánh giá dựa trên các mô tả về hành vi hung hăng được nêu trong Bảng 4 (Ayres-Peres và cộng sự, 2011; Zhu và cộng sự, 2021). Cụ thể, hành vi của cua con được phân loại thành ba cấp độ: tiếp cận hoặc đuổi theo, tiếp xúc vật lý nhẹ hoặc tấn công bằng cả hai càng và tấn công dữ dội. Sau đó, mỗi nhóm cua con được chấm điểm theo các định nghĩa chi tiết về các hành vi này để định lượng mức độ hung hăng của chúng. Thiết lập này được lặp lại 10 lần. Điểm hung hăng được tính theo công thức sau (Ayres-Peres và cộng sự, 2011; Zhu và cộng sự, 2021):
Điểm hung hăng = Số lần tiếp cận×1 + Số lần tiếp xúc×2 + Số lần chiến đấu×3
Bảng 4 Tiêu chí chấm điểm cho hành vi hung dữ của Scylla paramamosain
| Hệ thống phân cấp | Hành vi | Mô tả |
| 1 | Tiếp cận | Một con cua tiếp cận hoặc đuổi theo con cua khác dọc theo mép bể mà không có bất kỳ hành động hung hăng cụ thể nào. |
| 2 | Tiếp xúc | Một con cua chạm vào con cua kia bằng chân đi bộ hoặc trèo lên lưng đối thủ, nhưng không có hành vi hung hăng nào. Con cua cấp dưới liên tục tránh con cua ở trên hoặc nhanh chóng rút lui đến một khu vực xa hơn. Cả hai con cua đều mở càng và chạm hoặc đánh nhau bằng càng, tham gia vào cuộc đối đầu giữa càng và càng. Con cua bị đánh bại phải vật lộn để trốn thoát. |
| 3 | Chiến đấu | Con cua dùng càng để đẩy và kéo nhau, khóa và kiềm chế lẫn nhau. Con cua chiếm ưu thế trèo lên lưng con cua bị đánh bại, nhấc bổng hoặc thậm chí lật ngược đối thủ, tạo nên một cuộc chiến rất dữ dội. |
2.8. Phân tích thống kê
Tất cả dữ liệu được xử lý bằng thuật toán chuyển đổi hai bước như Templeton (2011) mô tả để ổn định phương sai, sau đó là kiểm định Shapiro-Wilk để đánh giá tính chuẩn và kiểm định Levene để kiểm tra tính đồng nhất của các phương sai. Để phân tích sự khác biệt về đặc điểm tăng trưởng, thành phần dinh dưỡng, hành vi và các chỉ số liên quan đến miễn dịch của cua con dưới các nồng độ Trp khác nhau, dữ liệu không tuân theo phân phối chuẩn (hành vi và biểu hiện gen) đã được phân tích bằng các kiểm định phi tham số (kiểm định Kruskal-Wallis), sau đó là kiểm định Steel-Dwass để so sánh nhiều lần. Dữ liệu còn lại tuân theo phân phối chuẩn ban đầu được đưa vào phân tích phương sai một chiều ANOVA, sau đó là kiểm định Tukey sau hoc để so sánh nhiều lần. Ngoài ra, để khám phá mối quan hệ giữa mức Trp và các thông số được đo, một phân tích thành phần chính (PCA) đã được tiến hành trên các chỉ số này. Tất cả các phân tích đều được thực hiện bằng phần mềm SPSS 26.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, Hoa Kỳ) và R 3.3.3 (Nhóm R Core, 2016).
…Còn tiếp…
Theo Wenping Feng, Zeping Zhao, Hanying Xu, Xueting Liu, Tao Han, Jiteng Wang
Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Bình Minh Capital
Xem thêm:
- Thông Số Tăng Trưởng Của Tôm Thẻ Chân Trắng Litopenaeus vannamei Và Rong Đỏ Gracilaria corticata Trong Phương Pháp Nuôi Tổng Hợp Trong Hệ Thống Không Thay Nước
- Các Chiến Lược Kiểm Soát Hội Chứng Hoại Tử Gan Tụy Cấp Tính (AHPNS/EMS) Và Bệnh Vibrio Gây Tử Vong Cao (HLVD/GPD/TPD) (Phần 1)
- Bột Vỏ Chanh Dây Dùng Trong Khẩu Phần Ăn Giúp Tăng Cường Hệ Miễn Dịch Cho Cá Rô Phi