Các Chất Hóa Học Thực Vật Bromelain Có Thể Tăng Cường Sự Phát Triển Và Cung Cấp Khả Năng Bảo Vệ Lâu Dài Cho Tôm Chống Lại AHPND

Nghiên cứu này là báo cáo đầu tiên về hiệu quả của bromelain trong khẩu phần ăn trong việc giảm thiểu AHPND và có thể là các bệnh liên quan đến Vibrio khác ở tôm

Việc ứng dụng rộng rãi các dòng tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) gia hóa sạch bệnh đặc hiệu (SPF) đã góp phần làm giảm đáng kể nguy cơ lây nhiễm nhiều loại vi-rút. Tuy nhiên, các bệnh do vi khuẩn vẫn tiếp tục là thách thức lớn, ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất của nhiều cơ sở nuôi tôm. Trong những năm gần đây, sự bùng phát của bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) do vi khuẩn gây ra đã dẫn đến thiệt hại kinh tế nghiêm trọng trong giai đoạn nuôi thương phẩm. Bệnh được ghi nhận lần đầu tại Trung Quốc vào năm 2009, sau đó lan sang Việt Nam, Malaysia và Thái Lan trong vòng ba năm tiếp theo. Tiếp đến, AHPND xuất hiện tại Mexico (2013), Philippines (2014), và được báo cáo tại Nam Mỹ, Hàn Quốc (2016), Bangladesh, Hoa Kỳ (2017) và Costa Rica (2020). Với tốc độ lây lan nhanh chóng trên phạm vi toàn cầu, vượt qua nhiều quốc gia và châu lục, AHPND được xem là một đại dịch do vi khuẩn trong ngành nuôi tôm hiện đại.

Sự xuất hiện của AHPND đã dẫn đến việc sử dụng kháng sinh nhiều hơn ở Châu Á, do đó, vi khuẩn gây ra AHPND được báo cáo có khả năng kháng thuốc kháng sinh với nhiều loại kháng sinh bao gồm cả khả năng kháng tetracycline qua plasmid ở V. parahaemolyticus. Do những lo ngại về môi trường và sức khỏe con người liên quan đến việc sử dụng kháng sinh quá mức, các chất phụ gia thức ăn có nguồn gốc thực vật, được gọi chung là phytogenics hoặc phytobiotics, ngày càng được coi là những lựa chọn thay thế tiềm năng cho kháng sinh.

Hiệu quả của nhiều chiết xuất thực vật trong việc làm giảm AHPND ở tôm là do tác động của nhiều hợp chất hoạt tính sinh học khác nhau của chúng. Gần đây chúng tôi đã nghiên cứu tiềm năng của chiết xuất dứa (Ananas comosus); hợp chất hoạt tính sinh học phổ biến có trong chiết xuất dứa là bromelain. Các nghiên cứu đã báo cáo rằng bromelain có nhiều hoạt tính enzym, chống phù nề, chống huyết khối và chống viêm trong số những lợi ích khác thúc đẩy sức khỏe con người.

Điều đặc biệt quan tâm trong dinh dưỡng động vật là đặc tính kháng khuẩn của bromelain, được báo cáo ức chế sự phát triển của các tác nhân gây bệnh đường ruột như Vibrio cholera và Escherichia coli; bromelain ức chế sản xuất độc tố của vi khuẩn, do đó ngăn ngừa tiêu chảy do E. coli và V. cholera ở động vật. Mặc dù cơ chế hoạt động chính xác vẫn chưa được biết, nhưng tác dụng này của bromelain đạt được bằng cách tương tác với các con đường truyền tín hiệu tiết ruột hoặc do tác dụng chống bám dính, có thể do thay đổi các vị trí thụ thể theo phương pháp phân giải protein, ngăn ngừa vi khuẩn gây bệnh bám vào các thụ thể nằm trên niêm mạc ruột.

Thực tế cho thấy bromelain có hiệu quả chống lại độc tố protein của E. coli và V. cholera nhắm vào đường tiêu hóa của động vật và với độc tố cholera là một thành viên của họ độc tố AB, chúng tôi quyết định nghiên cứu xem bromelain có hiệu quả chống lại AHPND do độc tố protein PirAB nhắm vào hệ tiêu hóa (gan tụy) của tôm hay không. Đây là báo cáo đầu tiên về hiệu quả của bromelain trong việc kiểm soát các bệnh do Vibrio, bao gồm AHPND, ở tôm thẻ chân trắng P. vannamei.

Thử nghiệm cho ăn và thử nghiệm cảm nhiễm

Bốn khẩu phần ăn thực tế đã được sản xuất bằng cách sử dụng thức ăn tôm thương mại giai đoạn hậu ấu trùng (Post Larva II crumbles #902, Gold Coin Specialities Ltd., Malaysia) làm công thức cơ bản. Việc sử dụng thức ăn tôm thương mại làm cơ sở cho phép chúng tôi đánh giá hiệu quả tiềm ẩn thực tế của bromelain nếu nó được thêm vào thức ăn thương mại. Thức ăn tôm thương mại được nghiền thành bột mịn trước khi được ép viên. Khẩu phần ăn đối chứng dương tính (posCON) và âm tính (negCON) bao gồm thức ăn tôm thương mại được ép viên lại với việc bổ sung chất kết dính viên (Pegabind^®, Bentoli AgriNutrition Co., Ltd., Thái Lan). Chỉ có tôm được cho ăn khẩu phần ăn posCON sau đó mới được cảm nhiễm với V. parahaemolyticus (VP_AHPND). Hai khẩu phần ăn khác có chứa 1% (1% BM) hoặc 2% (2% BM) bột bromelain chiết xuất từ ​​​​dứa (Anatara Lifesciences Ltd., Brisbane, Úc) với chi phí là alpha-cellulose cũng đã được ép viên. Khẩu phần ăn đối chứng không bổ sung thêm BM.

Bốn nhóm tôm được cho ăn thủ công với khẩu phần ăn tương ứng ba lần mỗi ngày cho đến khi thấy no trong 28 ngày. Sau khi thử nghiệm tăng trưởng hoàn tất, tôm từ mỗi khẩu phần ăn được lấy ra khỏi mỗi bể, gom lại và sau đó thả lại vào mỗi bể để thử nghiệm cảm nhiễm.

Thử nghiệm cảm nhiễm AHPND đầu tiên sử dụng 23 con tôm cho mỗi lần lặp lại (bốn lần lặp lại cho mỗi khẩu phần ăn) trong 10 ngày. Sau lần thử nghiệm cảm nhiễm đầu tiên, những con tôm sống sót được gộp lại theo nghiệm thức khẩu phần ăn với ba lần lặp lại và sắp xếp thành 15 con tôm cho mỗi lần lặp lại. Tất cả tôm được chuyển sang khẩu phần ăn đối chứng (0% BM) trong 14 ngày trước khi được cảm nhiễm lại với AHPND. Đây được coi là thời gian đào thải và được sử dụng như một cách gián tiếp để quan sát xem việc bổ sung bromelain trước đó vào khẩu phần ăn có tác dụng lâu dài đến sức khỏe của tôm hay không. Sau đó, thử nghiệm cảm nhiễm AHPND thứ hai được tiến hành trong 10 ngày tiếp theo. Lịch trình của thử nghiệm cho ăn, thời gian đào thải và các thử nghiệm cảm nhiễm AHPND được minh họa tuần tự như trong Hình 1.

Thử nghiệm cảm nhiễm được thực hiện bằng phương pháp ngâm. Tôm từ mỗi bể nuôi trong nhóm posCON, 1%BM hoặc 2%BM được đặt trong 15 phút (có sục khí) trong bình Erlenmeyer 1 lít chứa 150 mL nuôi cấy VP_AHPND (10⁸ CFU/mL). Sau đó, hỗn dịch vi khuẩn bao gồm tôm được đổ trực tiếp trở lại bể nuôi tương ứng có chứa nước biển nhân tạo sạch. Nghiệm thức đối chứng âm tính (negCON) được đưa vào để làm đối chứng môi trường và tôm không được cảm nhiễm với VP_AHPND mà được ngâm trong môi trường tryptic soy broth vô trùng cộng với 1,5% NaCl. Tất cả tôm được quan sát ba giờ một lần để theo dõi các dấu hiệu lâm sàng chung và tỷ lệ chết.

Các thông tin chi tiết toàn diện về phương pháp luận được sử dụng và kết quả trong ấn phẩm gốc [Ng, WK và ML Mong. 2024. Bromelain trong khẩu phần ăn từ chiết xuất dứa giúp tăng cường hiệu suất tăng trưởng và điều chỉnh hệ vi khuẩn đường ruột, giúp bảo vệ tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei lâu dài khỏi bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) do Vibrio parahaemolyticus gây ra. Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2024, Mã bài báo 6492170, 14 trang.

Hiệu quả của hóa chất thực vật bromelain

Hiệu suất tăng trưởng của tôm được cho ăn khẩu phần ăn bổ sung bromelain cải thiện so với nhóm đối chứng. Đặc biệt, tôm được cho ăn 2% BM hầu hết có trọng lượng cuối cùng, phần trăm tăng trọng, tăng trọng hàng ngày, tốc độ tăng trưởng riêng và lượng thức ăn tiêu thụ cao hơn đáng kể (P < 0,05) so với tôm được cho ăn khẩu phần ăn đối chứng. Tuy nhiên, hiệu suất tăng trưởng không cao hơn đáng kể (P > 0,05) so với tôm được cho ăn 1% BM. Tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR) là tuyệt vời với các giá trị gần bằng 1,0 ở tất cả các khẩu phần ăn và tỷ lệ sống của tôm cao (95–100%).

Nhóm negCON (không cảm nhiễm với AHPND) cho thấy tỷ lệ sống của tôm là 95-98% trong hai thử nghiệm cảm nhiễm, điều này khẳng định rằng các quy trình và hệ thống thử nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu hiện tại không gây căng thẳng đáng kể cho tôm hoặc gây ra trường hợp chết không mong muốn. Trong thử nghiệm cảm nhiễm AHPND đầu tiên, tôm được cho ăn khẩu phần ăn 1% BM cho thấy tỷ lệ sống cao nhất (84,8 ± 3,8%), tiếp theo là 2% BM (78,3 ± 2,5%), cả hai đều cao hơn đáng kể so với nhóm posCON (69,5 ± 1,8%) (Hình 2). Sau thời gian đào thải và thử nghiệm cảm nhiễm lại tôm với AHPND (cảm nhiễm AHPND lần thứ hai), tôm trước đó được cho ăn 1% hoặc 2% BM cho thấy tỷ lệ sống cao hơn đáng kể ở mức 71,1 ± 9,7% và 73,3 ± 3,8%, so với nhóm posCON có tỷ lệ sống thấp nhất ở mức 51,1 ± 2,2% (Hình 2).

Kết quả cho thấy việc bổ sung 2% BM làm giảm đáng kể sự khác biệt về tỷ lệ sống trung bình (3,5%) giữa thử nghiệm cảm nhiễm AHPND đầu tiên và thứ hai so với nhóm posCON (18,5%), trong khi tôm ăn 1% BM là 14,4%. Xem xét rằng sự khác biệt về tỷ lệ sống của tôm giữa thữ nghiệm cảm nhiễm AHPND đầu tiên và thứ hai đối với nhóm negCON là khoảng 3,0%, thì sự gia tăng nhỏ về tỷ lệ chết của tôm được quan sát thấy ở nhóm 2% BM trong thử nghiệm cảm nhiễm thứ hai có thể không phải do AHPND.  Tôm chết có thể do gan tụy bị tổn thương (Hình 3).

Hệ vi khuẩn đường ruột

Hệ vi khuẩn đường ruột được biết ảnh hưởng đến việc điều chỉnh sức khỏe và bệnh tật của tôm. Cộng đồng vi khuẩn dạ dày của tôm bị nhiễm VP_AHPND được cho ăn khẩu phần ăn bổ sung BM cho thấy sự đa dạng alpha cao nhất theo Chỉ số Simpson. Chỉ số Simpson cao cho thấy số lượng ASV (biến thể trình tự amplicon) cao và tỷ lệ ASV tương tự nhau hơn. Sự đa dạng vi khuẩn trong nhóm posCON là thấp nhất trong tất cả các nhóm và bị giảm so với tôm không được cảm nhiễm trong nhóm negCON.

Ở cấp độ ngành, cấu trúc cộng đồng vi khuẩn chủ yếu bao gồm Proteobacteria, Actinobacteria và Bacteroidetes với độ phong phú tương đối dồi dào trên tất cả các nghiệm thứuc (Hình 4). Nhóm posCON cho thấy độ phong phú của Tenericutes và Bacteroidetes tăng tương đối và độ phong phú Actinobacteria giảm tương đối so với nhóm negCON không bị cảm nhiễm. So với nhóm posCON, cộng đồng vi khuẩn trong dạ dày của tôm được cho ăn khẩu phần ăn 1% BM cho thấy độ phong phú Verrucomicrobia và Planctomycetes và độ phong phú Tenericutes tương đối giảm. Đối với nhóm 2% BM, đã được quan sát thấy độ phong phú của Proteobacteria tăng lên đáng kể và độ phong phú Tenericutes giảm trong dạ dày.

Độ phong phú của chi vi khuẩn Luteolibacter được xác định là một trong những đặc điểm có ý nghĩa thống kê và cung cấp thông tin sinh học phân biệt nhóm 1% BM và 2% BM so với nhóm đối chứng (Hình 5). Độ phong phú Luteolibacter giảm trong dạ dày của tôm được cho ăn khẩu phần ăn bổ sung BM có thể đóng vai trò là một dấu ấn sinh học tiềm năng. Độ phong phú chi vi khuẩn Vibrio tương đối trong bốn nghiệm thức được mô tả trong Hình 6. Vi khuẩn Vibrio nhiều nhất ở nhóm posCON. Việc bổ sung bromelain vào khẩu phần ăn, bất kể mức độ ăn, có xu hướng làm giảm độ phong phú Vibrio trong dạ dày tôm. Độ phong phú vi khuẩn Vibrio thấp nhất được quan sát thấy ở dạ dày của nhóm negCON.

Tiềm năng của hóa chất thực vật bromelain

Bromelain là một phức hợp enzyme bao gồm hỗn hợp các thiol endopeptidases khác nhau với các thành phần phụ khác như phosphatase, cellulase, glucosidase, peroxidase, glycoprotein, carbohydrate, v.v. Bromelain là enzyme sulfhydryl proteolytic chiếm ưu thế có trong dứa. Bromelain thương mại chủ yếu được chiết xuất từ ​​thân và quả dứa, nhưng nó cũng có thể được phân lập với số lượng nhỏ từ chất thải của dứa như lá, vỏ và ngọn. Bromelain ở thân dứa (EC 3.4.22.32) được biết có các đặc tính sinh hóa, hoạt tính sinh học và thành phần khác so với bromelain ở quả dứa (EC 3.4.22.33). Do đó, khi so sánh các nghiên cứu được tiến hành với bromelain nên xem xét phần nào của quả dứa được sử dụng để chiết xuất, hoạt tính của enzyme thu được, thành phần và độ tinh khiết của sản phẩm bromelain. Hơn nữa, các nghiên cứu tiến hành sử dụng chiết xuất thô từ nhiều bộ phận khác nhau của quả dứa thay vì bromelain tinh khiết cũng sẽ chứa các hợp chất hoạt tính sinh học nhỏ khác như saponin, flavonoid, alkaloid và tannin có thể làm tăng thêm kết quả nghiên cứu.

Hiện có rất ít thông tin về tác động của BM trong khẩu phần ăn đối với hiệu suất tăng trưởng của động vật thủy sinh. Thử nghiệm tăng trưởng hiện tại cho thấy việc bổ sung bromelain vào thức ăn của tôm thẻ chân trắng nói chung làm tăng hiệu suất tăng trưởng, đặc biệt là ở mức 2% BM trong khẩu phần ăn. Việc bổ sung bromelain lên đến 2% vào khẩu phần ăn không ảnh hưởng đến độ ngon miệng hoặc độc tính của thức ăn, bằng chứng là tỷ lệ sống cao của tôm với lượng thức ăn tiêu thụ và FCR thấp. Hiệu suất tăng trưởng của tôm được cải thiện khi cho ăn khẩu phần ăn bổ sung BM có thể một phần do tình trạng sức khỏe của tôm được cải thiện. Các yếu tố khác góp phần vào sự cải thiện tăng trưởng được quan sát thấy trong nghiên cứu hiện tại có thể bao gồm tăng cường khả năng tiêu hóa chất dinh dưỡng và/hoặc những thay đổi có lợi đối với hình thái ruột giúp hấp thụ chất dinh dưỡng tốt hơn.

Nghiên cứu này là báo cáo đầu tiên về hiệu quả của bromelain trong khẩu phần ăn trong việc làm giảm AHPND và có thể là các bệnh liên quan đến Vibrio khác ở tôm. Số lượng Vibrio dự kiến ​​và tổng số lượng vi khuẩn có thể nuôi cấy trong gan tụy của tôm trước đây được cho ăn khẩu phần ăn bổ sung BM thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng dương tính sau cả hai thử nghiệm cảm nhiễm AHPND. Tỷ lệ vi khuẩn Vibrio trong dạ dày của tôm được cho ăn khẩu phần ăn bổ sung BM cũng thấp hơn đáng kể so với posCON (Hình 6).

Hiện nay, cơ chế kháng khuẩn cụ thể của bromelain vẫn chưa được làm rõ. Tuy nhiên, kết quả của nghiên cứu này đã góp phần làm sáng tỏ thêm cơ chế tác động của hợp chất này. Trong giai đoạn đào thải kéo dài 14 ngày, khi toàn bộ tôm được chuyển sang khẩu phần đối chứng không bổ sung bromelain trước lần thử nghiệm cảm nhiễm AHPND thứ hai, khả năng kháng bệnh của tôm không hoàn toàn phụ thuộc vào tác động trực tiếp của bromelain trong cơ thể. Kết quả cho thấy việc bổ sung bromelain trong khẩu phần ăn mang lại những lợi ích lâu dài đối với sức khỏe của tôm. Cụ thể, ở nhóm bổ sung 2% BM, tỷ lệ sống trong hai lần thử nghiệm cảm nhiễm AHPND gần như tương đương nhau, sau khi đã hiệu chỉnh theo tỷ lệ tử vong của nhóm đối chứng âm tính không cảm nhiễm (Hình 2). Ngược lại, ở nhóm đối chứng dương tính (posCON), tỷ lệ sống tiếp tục giảm thêm 18,5% trong lần cảm nhiễm thứ hai, khiến tỷ lệ sống tích lũy chỉ còn 51,1%.

Tỷ lệ chết cao hơn được quan sát thấy trong thử nghiệm cảm nhiễm AHPND thứ hai so với thử nghiệm cảm nhiễm đầu tiên trong nhóm posCON vì tôm không có khả năng miễn dịch thích ứng tạo ra trí nhớ miễn dịch để tăng cường phản ứng với phơi nhiễm thứ cấp với cùng một tác nhân gây bệnh. Tôm trong nhóm posCON có khả năng bị suy yếu do cảm nhiễm bệnh đầu tiên dẫn đến tỷ lệ chết cao hơn khi cảm nhiễm lần thứ hai.

Dựa trên kết quả của nghiên cứu hiện tại, chúng tôi giả định rằng cơ chế kháng khuẩn của bromelain có thể không hoàn toàn dựa vào khả năng ức chế trực tiếp các tác nhân gây bệnh xâm nhập. Các nghiên cứu trên người cho thấy bromelain có thời gian bán hủy trong huyết tương dao động từ 6 đến 9 giờ, do đó khó có khả năng tích tụ sinh học trong các mô. Vì quá trình cảm nhiễm AHPND xảy ra thông qua sự xâm nhập của vi khuẩn Vibrio gây bệnh tại dạ dày tôm, những cải thiện tích cực đối với hệ vi sinh đường ruột do bromelain trong khẩu phần ăn điều hòa có thể đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sức khỏe lâu dài và tăng cường đáp ứng miễn dịch của tôm khi đối mặt với AHPND.

Kết luận

Nghiên cứu này lần đầu tiên cung cấp bằng chứng về vai trò và tầm quan trọng của hệ vi sinh vật đường ruột đa dạng trong việc duy trì sức khỏe tôm và tăng cường khả năng kháng lại bệnh AHPND, ngay cả khi khẩu phần ăn không còn chứa trực tiếp các hợp chất hóa học thực vật như bromelain. Đáng chú ý, tác dụng bảo vệ của bromelain vẫn được duy trì ở tôm sau khi chuyển sang khẩu phần đối chứng không bổ sung bromelain trong hai tuần (giai đoạn đào thải) trước khi tiến hành thử thách AHPND lần thứ hai.

Sự đa dạng alpha cao nhất được quan sát thấy ở tôm bị nhiễm VP_AHPND được cho ăn khẩu phần ăn bổ sung bromelain. Những thay đổi tương đối trong cộng đồng vi khuẩn dạ dày biểu hiện rõ ràng trong các nghiệm thức. Vi khuẩn thuộc các chi Luteolibacter, Paracoccus, Planctomyces và Demequina góp phần đáng kể vào sự khác biệt về tính đa dạng giữa các nghiệm thức và đặc biệt được làm giàu trong các nghiệm thức cho ăn BM. Các vai trò thực sự của BM do những thay đổi trong cộng đồng vi khuẩn này vẫn đang được nghiên cứu.

Tóm lại, nghiên cứu hiện tại cho thấy việc điều chỉnh hệ vi khuẩn đường ruột thông qua việc sử dụng các chất hóa học thực vật như bromelain có thể là một giải pháp thay thế cho các loại kháng sinh phổ rộng có hại trong việc quản lý bệnh ở tôm nuôi chống lại AHPND và có thể là các bệnh do Vibrio khác. Dựa trên các kết quả xét nghiệm này, chúng tôi khuyến nghị mức bromelain trong khẩu phần ăn là 2% để tăng cường hiệu suất tăng trưởng và khả năng kháng bệnh chống lại AHPND.

Theo Wing-Keong Ng, Mei-Ling Mong

Nguồn: https://www.globalseafood.org/advocate/bromelain-phytochemicals-can-enhance-growth-and-provide-longer-term-protection-to-shrimp-against-ahpnd/

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Bình Minh Capital

Xem thêm:

• Thông Số Tăng Trưởng Của Tôm Thẻ Chân Trắng Litopenaeus vannamei Và Rong Đỏ Gracilaria corticata Trong Phương Pháp Nuôi Tổng Hợp Trong Hệ Thống Không Thay Nước
• Các Chiến Lược Kiểm Soát Hội Chứng Hoại Tử Gan Tụy Cấp Tính (AHPNS/EMS) Và Bệnh Vibrio Gây Tử Vong Cao (HLVD/GPD/TPD) (Phần 1)
• Bột Vỏ Chanh Dây Dùng Trong Khẩu Phần Ăn Giúp Tăng Cường Hệ Miễn Dịch Cho Cá Rô Phi