Aeromonas hydrophila, Tác Nhân Gây Bệnh Trên Tôm Thẻ Chân Trắng Litopenaeus vannamei Nuôi Nước Ngọt

Tóm tắt

Aeromonas hydrophila là một loại vi khuẩn gây bệnh phổ biến liên quan đến hiện tượng chết hàng loạt trong nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, có rất ít báo cáo cho thấy A. hydrophila gây bệnh ở tôm thẻ chân trắng. Trong nghiên cứu này, phân lập độc lực WS05 cho thấy đây là tác nhân gây bệnh cho tôm thẻ chân trắng nuôi nước ngọt và liều gây chết trung bình (LD50) là 4,8 × 104 CFU/ mL. Nó được xác định về mặt kiểu hình và phân tử là A. Hydrophila và thể hiện tính nhạy cảm với một số loại kháng sinh thú y được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản, bao gồm cotrimoxazole, doxycycline, florfenicol, neomycin và tetracycline. Xét về vùng ức chế mạnh nhất của florfenicol đối với phân lập WS05, tác dụng hiệp đồng của sự kết hợp giữa florfenicol và chiết xuất thảo mộc đã được đánh giá thêm, và kết quả chỉ ra rằng chiết xuất Punica granatum là một chất hiệp đồng tiềm năng của florfenicol đối với chủng WS05 và nồng độ ức chế phân đoạn chỉ số (FICI) cho chiết xuất florfenicol- P. granatum được tính là 0,31. Khi kết hợp với 7,81 mg/ mL chiết xuất P. granatum, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của florfenicol đối với chủng WS05 đã giảm từ 0,50 xuống 0,03 mg/L và hoạt tính đối với chủng WS05 cũng được tăng cường với mật độ tế bào giảm đáng kể ≥3,61 log sau 24 giờ so với điều trị bằng thuốc đơn lẻ. Ngoài ra, sự kết hợp của florfenicol và chiết xuất P. Granatum đã nâng cao hiệu quả phòng ngừa, với tỷ lệ chết tích lũy là 36,66% (p < 0,05) và 33,33% (p < 0,05) thấp hơn so với điều trị đơn lẻ bằng florfenicol và chiết xuất P. granatum sau cảm nhiễm với chủng WS05 trong 7 ngày. Theo chúng tôi được biết, đây là nghiên cứu đầu tiên mô tả tác nhân gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng A. hydrophila và đề xuất chiết xuất quả lựu P. granatum như một hợp chất tiềm năng của florfenicol chống lại mầm bệnh A. hydrophila.

1. Giới thiệu

Tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei là một trong những loài tôm thương phẩm quan trọng nhất và được nuôi rộng rãi ở Trung và Nam Mỹ, Hoa Kỳ (USA), Đông Á và Đông Nam Á, Trung Đông và Châu Phi, chiếm 75% sản phẩm tôm toàn cầu. Đặc biệt ở Trung Quốc, với công nghệ kỹ thuật nuôi đã phát triển nhanh chóng, tôm thẻ chân trắng đã được nuôi thành công trong nước ngọt từ năm 2000, với sản lượng nuôi nước ngọt hàng năm đạt trên 591.000 tấn vào năm 2017. Tuy nhiên, ngành công nghiệp này đã bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi các bệnh do vi khuẩn gây ra bởi nhiều loài như Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi, Vibrio cholerae, Proteus penneri, Aeromonas schubertii Shewanella algae. Để phòng ngừa và kiểm soát các bệnh do vi khuẩn gây ra, kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong nuôi tôm thẻ chân trắng. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh rộng rãi và thường xuyên trong nuôi tôm đã dẫn đến  gia tăng kháng  kháng sinh giữa các mầm bệnh lây nhiễm cho động vật nuôi và con người. Các loại thảo mộc có khả năng kháng khuẩn chống lại Aeromonas hydrophila có vai trò quan trọng trong việc quản lý dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản. Chiết xuất từ ​​các loại thảo mộc, chẳng hạn như cây thủy xương bồ Acorus calamus, cây chàm nhuộm Indigofera aspalathoides, cây húng chanh Coleus aromaus, cây cỏ xạ hương Thymus Vulgaris và một loài cây có hoa trong họ Đậu Trifolium pannonicum, đã được báo cáo là có hiệu quả ức chế vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh. Nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh rằng  việc bổ sung chiết xuất từ ​​các loại thảo mộc qua đường miệng, chẳng hạn như tỏi Allium sativum, cây liễu lông Epilobium hirsutum, cây sâm Panax quinquefolium và cây Hương xuân Toona sinensis có thể tăng cường đáng kể sức đề kháng và chống nhiễm trùng A. hydrophila ở cá. Do đó, để hạn chế sử dụng kháng sinh, việc sử dụng chiết xuất thảo mộc kết hợp với kháng sinh thông thường thường được đề xuất để điều trị vi khuẩn gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản, điều này có thể làm giảm đáng kể liều lượng kháng sinh chống lại vi khuẩn gây bệnh. Jedlickova và cộng sự (1992) phát hiện ra rằng sự kết hợp của 1,8-cineol, linalool và terpinen-4-ol với amikacin, gentamicin và tobramycin có thể ức chế mạnh mẽ sự phát triển của Escherichia coli; Jayaraman và cộng sự (2010) cho thấy rằng sự kết hợp của sulfamethoxazole và myricetin có thể tăng cường đáng kể các hoạt động kháng khuẩn chống lại các chủng Pseudomonas aeruginosa. Tuy nhiên, có rất ít tài liệu về vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh cho tôm thẻ chân trắng và việc kiểm soát bằng sự kết hợp của chiết xuất thảo mộc và kháng sinh.

Cuối tháng 5/2019, một căn bệnh nghiêm trọng với các dấu hiệu điển hình là teo gan tụy đã xảy ra ở gần như toàn bộ vùng nuôi tôm của Fengxian, Thượng Hải, Trung Quốc và dẫn đến tỷ lệ chết tích lũy từ 50% đến 100%. Nghiên cứu này xác nhận chủng A. hydrophila độc lực là tác nhân gây bệnh ở tôm thẻ chân trắng nuôi nước ngọt, và vị trí phân loại, độc lực và tính nhạy cảm với kháng sinh đã được kiểm tra. Hơn nữa, xét về vùng ức chế mạnh nhất của florfenicol đối với chủng phân lập, việc kiểm soát chủng phân lập với sự kết hợp của florfenicol và chiết xuất thảo mộc đã được đánh giá thêm. Theo hiểu biết của chúng tôi, đây là báo cáo đầu tiên cho thấy A. Hydrophila là vi khuẩn gây bệnh cho tôm thẻ chân trắng nuôi nước ngọt, và những phát hiện của nghiên cứu này có thể được sử dụng làm tài liệu tham khảo để kiểm soát dịch bệnh và quản lý sức khỏe trong nuôi tôm.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Tôm và các chất thử

20 con tôm thẻ chân trắng nuôi nước ngọt sắp chết (trọng lượng 6,80 ± 0,05 g) bị teo gan tụy đã được lấy mẫu từ một ao nước ngọt bị nhiễm bệnh của một trang trại nuôi tôm ở Fengxian, Thượng Hải, Trung Quốc trong tháng 5/2019 và được đặt vào túi vô trùng và giữ trên đá trong suốt quá trình vận chuyển 1 giờ đến phòng thí nghiệm theo khuyến nghị của Jayasinghe và cộng sự (2008). Tổng cộng, 340 con tôm khỏe mạnh (5,26 ± 0,36 g) cho xét nghiệm nhiễm bệnh được lấy từ các ao không bị ảnh hưởng của một trang trại nuôi tôm ở Công ty TNHH Nuôi trồng Thủy sản Liên Vân Cảng, Giang Tô, Trung Quốc và được nuôi trong 34 bể kính (76 cm × 50 cm × 48 cm) (10 con tôm mỗi bể) với 100 L nước trang trại được lọc có sục khí theo khuyến nghị của Moss và cộng sự (1992, 2001) với độ pH ban đầu là 7,50, 6,2 mg/ L oxy hòa tan, 0,11 mg/ L tổng amoniac và 0,01 mg/ L nitrit ở 28°C trong 14 ngày. Tiếp theo, 240 con tôm khỏe mạnh (0,62 ± 0,11 g) để thử nghiệm tác dụng bảo vệ được lấy từ các ao không bị ảnh hưởng của một trang trại nuôi tôm ở Công ty TNHH Nuôi trồng thủy sản Rudong, Giang Tô, Trung Quốc và được duy trì trong bể 24 ô kính (76 cm × 50 cm × 48 cm) (10 con tôm mỗi bể) được cung cấp 100L nước trang trại được lọc có sục khí với độ pH ban đầu là 7,64, 6,6 mg/ L oxy hòa tan, 0,10 mg/ L tổng amoniac và 0,01 mg/ L của nitrit ở 28°C trong 14 ngày. Tình trạng sức khỏe được đánh giá thông qua kiểm tra cẩn thận về hình thức bên ngoài, tình trạng đường ruột, tình hình tăng trưởng, hành vi thể chất và xu hướng cho ăn theo khuyến cáo của Cơ quan Phát triển Xuất khẩu Sản phẩm Thủy sản và Mạng lưới các Trung tâm Nuôi trồng Thủy sản ở Châu Á – Thái Bình Dương (2003), cũng như bằng cách nuôi cấy phết tế bào hemolymp và gan tụy từ một số động vật được lấy mẫu trên các đĩa thạch dinh dưỡng (NA) (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Thượng Hải, Trung Quốc) để đảm bảo không có mầm bệnh theo khuyến cáo của Biswas và cộng sự (2012). Nước trang trại đã lọc được sử dụng trong phòng thí nghiệm đã được điều chế bằng cách cho 6 m3 nước, được lấy từ sông Luchaoyin tự nhiên, lần lượt qua sợi polyester có kích thước 15 denier và miếng bọt biển polyurethane 60 lỗ/ inch (ppi) trong thiết bị lọc nước (Shanghai Haisheng Biotech. Co., Ltd., Thượng Hải, Trung Quốc), với tốc độ dòng chảy 0,24 m3/ phút và tốc độ lưu thông 8 lần/ ngày theo khuyến nghị của Luo và cộng sự (2008), và được khử trùng ở 121°C trong 20 phút để loại bỏ vi khuẩn trước khi sử dụng. Florfenicol (98%) được mua từ Tianchen Biotech. Co. Ltd., Vũ Hán, Trung Quốc. Các loại thảo mộc được lấy từ Viện Sinh học Biển Sơn Đông, Sơn Đông, Trung Quốc. Thuốc thử thuộc loại phân tích của Công ty TNHH Thuốc thử hóa học Sinopharm, Thượng Hải, Trung Quốc.

2.2. Xác nhận tác nhân gây bệnh

Theo Cao và cộng sự (2014), mỗi mẫu tôm thẻ chân trắng bệnh được khử trùng bề  ngoài bằng cồn 75 độ và giải phẫu trong phòng thí nghiệm. Để xác minh các tác nhân gây bệnh tiềm ẩn, một khối các cơ quan (mang, gan tụy, cơ, ruột) đã được tạo ra và kiểm tra cẩn thận để tìm ký sinh trùng dưới kính hiển vi (YS100, Nikon, Tokyo, Nhật Bản) như mô tả của Ekanem và cộng sự (2011). Trong khi đó, xét nghiệm virus học cũng được tiến hành như mô tả của Pan và cộng sự (2009). Tóm lại, dịch đồng nhất của các cơ quan (mang, gan tụy, cơ, ruột) được tạo ra và lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 0,22 μm để loại bỏ vi khuẩn. 2 bể gồm 10 con tôm khỏe mạnh được tiêm vào cơ với 0,1 mL mỗi dịch lọc cơ quan không có vi khuẩn. 2 bể khác gồm 10 con tôm khỏe mạnh, được tiếp xúc với cùng điều kiện thí nghiệm và được tiêm vào cơ 0,1 mL nước muối sinh lý, được dùng làm đối chứng. Tôm thí nghiệm được giữ ở 28°C mà không thay nước. Tỷ lệ chết và bất kỳ thay đổi có thể nhìn thấy nào của tôm thử nghiệm được ghi lại hàng ngày trong 15 ngày. Ngoài ra, các mẫu từ cơ quan (gan tụy, cơ) của từng con tôm bệnh được cắt và cấy trực tiếp lên đĩa NA theo khuyến cáo của Cao và cộng sự (2018). Sau khi ủ trong 24 giờ ở 28°C, các dòng phân lập thống nhất chiếm ưu thế đã được tinh chế bằng cách ria vạch và vạch lại trên các đĩa NA (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Thượng Hải, Trung Quốc). Chỉ những chủng phân lập chiếm ưu thế với sự phát triển nuôi cấy gần như thuần khiết dày đặc trên các đĩa NA mới thu được theo khuyến nghị của Orozova và cộng sự (2012) và Cao và cộng sự (2014). Sau khi được xác định ban đầu bằng giải trình tự gen 16S rRNA theo khuyến nghị của Petti và cộng sự (2005), các chủng phân lập tinh khiết được tiếp tục cấy vào đĩa NA, ủ ở 28°C trong 24 giờ và rửa bằng nước muối sinh lý vô trùng trong  một ống vô trùng. Mật độ tế bào được xác định bằng cách đếm các đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên các đĩa NA sau khi pha loãng nối tiếp 10 lần trong nước muối sinh lý vô trùng. Nhiễm khuẩn do các chủng phân lập  thuần đã được thực hiện theo Cao và cộng sự (2015). Tóm lại, 2 bể chứa 10 con tôm khỏe mạnh đã được cảm nhiễm bằng cách ngâm trong 100 L nước có chứa các chủng phân lập ở mật độ tế bào là 5,0 × 106 CFU/ mL. 2 bể khác gồm 10 con tôm khỏe mạnh, được tiếp xúc với cùng điều kiện thí nghiệm và được giữ cho không bị nhiễm bệnh, được dùng làm đối chứng. Tôm thí nghiệm được giữ ở 28°C mà không thay nước. Trong 7 ngày, tỷ lệ chết và bất kỳ thay đổi có thể nhìn thấy của tôm thí nghiệm đều được ghi lại hàng ngày. Tôm chết ngay lập tức được loại bỏ và lấy mẫu gan tụy trên đĩa NA để xác nhận xem tôm chết có phải do nhiễm các chủng vi khuẩn hay không. Bên cạnh đó, các phần siêu mỏng được chuẩn bị từ gan tụy của tôm bị nhiễm bệnh và tôm khỏe mạnh để kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử và ánh sáng như mô tả của Zhou và cộng sự (2012). Tóm lại, đối với kính hiển vi ánh sáng, gan tụy được cố định trong dung dịch Boun, sau đó khử nước trong một loạt cồn được phân loại (75%, 85%, 90%, 95%, 100%) (30 phút trong mỗi chất khử nước), làm sạch bằng xylol, được nhúng parafin, nhuộm bằng hematoxylin và eosin, sau đó được quan sát dưới kính hiển vi ánh sáng (Eclipse E100, Nikon, Tokyo, Nhật Bản). Đối với kính hiển vi điện tử truyền qua, gan tụy lần đầu tiên được cố định trong 2,5% glutaraldehyde trong 0,1 M PBS (pH 7,4) trong 2 giờ ở 4°C, tiếp theo là cố định sau trong 1% osmium tetroxide trong 2 giờ, được khử nước trong một chuỗi phân loại rượu (50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%) và axeton 100% (15 phút trong mỗi chất khử nước), nhúng vào nhựa Spurr, nhuộm bằng uranyl axetat và chì citrate, sau đó quan sát dưới một kính hiển vi điện tử truyền qua (HT770, Hitachi, Tokyo, Nhật Bản).

2.3. Xác định mầm bệnh gây bệnh

    • Nhận dạng phân tử

DNA bộ gen được chiết xuất từ ​​​​phân lập gây bệnh bằng cách sử dụng Bộ DNA TIANamp (Tiangen Biotech. Co., Ltd., Bắc Kinh, Trung Quốc). Theo Cao và cộng sự, các gen 16S rRNA, gyrB và rpoB từ phân lập gây bệnh được khuếch đại bằng PCR. (2010), Yáňez và cộng sự (2003), và Küpfer và cộng sự (2006), và giải trình tự bằng Máy giải trình tự DNA ABI 3730 XL (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). Tìm kiếm tương đồng trình tự gen 16S rRNA, gyrB và rpoB được thực hiện bằng phần mềm Basic Local Alignment Search Tool phiên bản 4 (BLAST) (Thư viện Y khoa Quốc gia, Bethesda, MD, Hoa Kỳ) có sẵn tại Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia (NCBI). Căn chỉnh trình tự được thực hiện với phần mềm Phân tích di truyền tiến hóa phân tử phiên bản 5 (MEGA5) (Đại học bang Arizona, Tempe, AZ, Hoa Kỳ) và các cây phát sinh gen được xây dựng bằng phương pháp neighbor-joining.

  • Nhận dạng kiểu hình

Việc xác định kiểu hình của phân lập gây bệnh được thực hiện bởi hệ thống API 20E (Biomerieux, Lyon, Pháp) theo khuyến nghị của Abeyta và cộng sự (2019). Tóm lại, chủng phân lập gây bệnh được nhuộm sọc trên đĩa NA được ủ ở 28°C trong 24 giờ, sau đó được cấy vào que thử API 20E (Biomerieux, Lyon, Pháp) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các que thử chứa vi khuẩn phân lập được ủ ở 37°C trong 18 giờ và quan sát các phản ứng sinh hóa. Đặc điểm kiểu hình của A. hydrophila được báo cáo trước đây bởi Long và cộng sự (2016) và Ye và cộng sự (2018) dùng làm tài liệu tham khảo.

2.4. Thí nghiệm độc lực vi khuẩn

Thí nghiệm độc lực của vi khuẩn bao gồm nhóm đối chứng và 5 nghiệm thức. Trước thí nghiệm này, chủng vi khuẩn gây bệnh được cấy vào đĩa NA, ủ ở 28°C trong 24 giờ và rửa bằng nước muối sinh lý vô trùng trong  ống vô trùng. Mật độ tế bào được xác định bằng cách đếm các đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên các đĩa NA sau khi pha loãng nối tiếp 10 lần trong nước muối sinh lý vô trùng. Mỗi nhóm chứa 2 bể thủy tinh (10 con tôm mỗi bể) với 100 L nước trang trại được lọc có sục khí. Trong các nhóm xử lý, tôm thử nghiệm trong bể thủy tinh được cảm nhiễm bằng cách ngâm với chủng phân lập gây bệnh ở mật độ tế bào cuối cùng là 2,0 × 103 đến 2,0 × 107 CFU/ mL trong nước theo khuyến nghị của Teng và cộng sự (2017). 2 bể tôm khỏe mạnh khác, được tiếp xúc với các điều kiện thí nghiệm tương tự và không bị cảm nhiễm, được dùng làm đối chứng. Tất cả tôm thử nghiệm được giữ ở 28°C mà không cần thay nước. Tỷ lệ chết được ghi lại hàng ngày trong 7 ngày. Tôm chết ngay lập tức được loại bỏ và lấy mẫu gan tụy trên đĩa NA để xác nhận xem tôm chết có phải do cảm nhiễm hủng vi khuẩn hay không. Giá trị liều gây chết trung bình (LD50) được tính bằng phương pháp đồ thị probit.

2.5. Xét nghiệm độ nhạy cảm với kháng sinh

Tính nhạy cảm của chủng gây bệnh đối với kháng sinh thú y đã được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán đĩa Kirby–Bauer được mô tả bởi Jones và cộng sự (2001) trên đĩa NA. Độ nhạy cảm được xác định bằng cách đo vùng ức chế sau khi ủ ở 28°C trong 24 giờ và được đánh giá theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Hangzhou Binhe Microorganism Reagent Co., Ltd., Hangzhou, China) theo khuyến cáo của Cao và cộng sự (2018).

2.6. Tác dụng hiệp đồng của xét nghiệm chiết xuất thảo mộc Florfenicol

Do vùng ức chế mạnh nhất của florfenicol đối với chủng gây bệnh được thể hiện trong xét nghiệm độ nhạy cảm với kháng sinh, nên florfenicol đã được chọn để nghiên cứu thêm. Tác dụng hiệp đồng của florfenicol kết hợp với chiết xuất thảo mộc đối với phân lập gây bệnh được đánh giá trong một đĩa vi thể 24 giếng bằng phương pháp bàn cờ được mô tả bởi Chen và cộng sự (2014). Trước thử nghiệm này, 1000 mg/ L florfenicol đã được chuẩn bị theo Liu và cộng sự (2011). Chiết xuất từ ​​vỏ quả lựu Punica granatum, quả mơ Prunus mume và quả xoan Fructus toosendan, lá cây ngải cứu Artemisia argyi, cây biển súc Polygonum aviculare, cây tiểu kế Cephalanoplos segetum, cây nhân trần bắc Artemisia capillaries và rễ của các loại thảo mộc khác đã được chuẩn bị với nước cất theo khuyến cáo của Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn (2009). Tóm lại, mỗi loại thảo mộc được sấy khô trong lò ở 80°C trong 72 giờ, nghiền mịn trong cối và chiết xuất bằng nước cất theo tỷ lệ 1:10 (w / v) bằng cách sử dụng bình đun sắc thuốc hoàn toàn tự động (Quảng Châu Haizhu Electric Co., Ltd., Quảng Châu, Trung Quốc). Hỗn hợp này sau đó được ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/ phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng và phần nổi phía trên được thu thập dưới dạng chiết xuất thảo mộc. Nồng độ của từng chiết xuất thảo mộc cho mỗi xét nghiệm được điều chỉnh thành 1000 mg/ mL (trọng lượng khô). Ngay sau khi vi khuẩn phân lập gây bệnh được bổ sung vào từng giếng trên đĩa với mật độ tế bào cuối cùng là 5 × 105 CFU/ mL theo khuyến nghị của Liu và cộng sự (2000), các chất chống vi trùng được nạp vào mỗi giếng với nồng độ nối tiếp nằm trong khoảng từ 0,125 đến 512 mg/ L đối với florfenicol và từ 1,95 đến 500 mg/ mL đối với chiết xuất thảo mộc. Các đĩa được ủ ở 28°C trong 24 giờ. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các chất chống vi trùng đơn lẻ hoặc kết hợp được xác định sau 24 giờ ủ, được xác định là nồng độ thấp nhất cho thấy không có sự thay đổi màu sắc thể hiện sự ức chế hoàn toàn sự phát triển theo Haroun và Al-Kayali (2016). Chỉ số nồng độ ức chế phân đoạn (FICI) được tính theo công thức theo khuyến nghị của Liu và cộng sự (2017): FICI = MIC (kết hợp florfenicol)/MIC (riêng florfenicol) + MIC (kết hợp chiết xuất thảo mộc)/MIC (chỉ riêng chiết xuất thảo mộc). Hiệu ứng chung được đánh giá theo các tiêu chí sau theo đề xuất của Gong và cộng sự (2005): Hiệu ứng cộng hưởng (FICI ≤ 0,5); tác dụng phụ (0,5 < FICI ≤ 1), không tương tác (1 < FICI < 4) và tác dụng đối kháng (FICI ≥ 4).

2.7. Thử nghiệm In Vitro chiết xuất Florfenicol-Herb

Hoạt tính in vitro của florfenicol kết hợp với chiết xuất thảo mộc có tác dụng hiệp đồng đã được kiểm tra bằng phương pháp đường cong  chết phụ thuộc vào thời gian (time kill-curve) theo khuyến nghị của Dong và cộng sự (2016). Thử nghiệm được thực hiện trong bình thủy tinh 50 mL và bao gồm một nhóm đối chứng và ba nhóm xử lý (ba bình mỗi nhóm). Ngay sau khi phân lập mầm bệnh được cấy vào 20 mL môi trường dinh dưỡng đã hấp tiệt trùng đến mật độ tế bào cuối cùng là 5,0 × 105 CFU/ mL theo khuyến nghị của Liu và cộng sự (2000), các chất kháng vi sinh vật được cấy độc lập vào môi trường dinh dưỡng hấp tiệt trùng trong các nhóm xử lý với nồng độ cuối cùng là 0,03 mg/ L florfenicol, 7,81 mg/ L chiết xuất P. granatum và 0,03 mg/ L florfenicol cộng với 7,81 mg/ mL chiết xuất P. granatum, được xác định bằng xét nghiệm tác dụng hiệp đồng ở trên. Tất cả các hỗn hợp sau đó được ủ ở 28°C trong 48 giờ theo khuyến nghị của Dong và cộng sự (2016). Trong nhóm đối chứng, chỉ chủng vi khuẩn gây bệnh được cấy vào môi trường dinh dưỡng đã hấp khử trùng đến mật độ tế bào cuối cùng là 5,0 × 105 CFU/ mL và được ủ như đã đề cập ở trên. Mật độ tế bào của phân lập gây bệnh được đo cứ sau 12 giờ bằng cách đếm số lượng đĩa trải trên đĩa NA.

2.8. Tác dụng bảo vệ chiết xuất Florfenicol-Herb

Thử nghiệm tác dụng bảo vệ bao gồm một đối chứng trống, một đối chứng âm tính, 3 đối chứng dương tính và 3 nghiệm thức. Trước khi thực hiện xét nghiệm này, chủng vi khuẩn gây bệnh được cấy vào đĩa NA, ủ ở 28°C trong 24 giờ và rửa bằng nước muối sinh lý vô trùng cho vào ống vô trùng. Mật độ tế bào được xác định bằng cách đếm CFU trên các đĩa NA sau khi pha loãng nối tiếp 10 lần trong nước muối sinh lý vô trùng. Mỗi nhóm chứa 3 bể thủy tinh (10 con tôm mỗi bể) với 100 L nước trang trại được lọc có sục khí. Trong các nhóm xử lý, chất kháng vi sinh vật được cấy độc lập vào nước trang trại được lọc có sục khí trong bể nuôi đến nồng độ cuối cùng là 0,03 mg/ L florfenicol, 7,81 mg/ L chiết xuất P. granatum và 0,03 mg/ L florfenicol cộng với 7,81 mg/ mL chiết xuất P. granatum, được xác định bằng xét nghiệm tác dụng hiệp đồng ở trên. Sau đó, tất cả tôm được cảm nhiễm bằng cách ngâm thông qua việc tiếp xúc liên tục với chủng phân lập gây bệnh ở mật độ tế bào cuối cùng là 2,0 × 106 CFU/ mL trong nước như đã xác định ở trên. Trong các nhóm đối chứng dương tính, tôm chỉ được điều trị bằng chất kháng vi trùng. Trong nhóm đối chứng âm tính, tôm chỉ bị cảm nhiễm bằng cách ngâm với chủng phân lập gây bệnh ở mật độ tế bào cuối cùng là 2,0 × 106 CFU/ mL trong nước như mô tả ở trên. 3 bể tôm khỏe mạnh khác, được tiếp xúc với các điều kiện thí nghiệm tương tự và không bị cảm nhiễm, được dùng làm đối chứng trống. Tất cả tôm thử nghiệm được giữ ở 28°C mà không thay nước. Tỷ lệ chết được ghi lại hàng ngày trong 7 ngày. Tôm chết ngay lập tức được loại bỏ và lấy mẫu gan tụy trên đĩa NA để xác nhận xem tôm chết có phải do cảm nhiễm chủng vi khuẩn hay không.

2.9. Phân tích thống kê

Phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm thống kê SPSS 15.0 (SPSS, Inc.) để quan sát sự khác biệt trong mỗi xét nghiệm. Tất cả dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) cho số lượng được chỉ định của mỗi xét nghiệm. Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê với p <0,05 bằng cách sử dụng phân tích phương sai theo thử nghiệm của Duncan.

2.10. Tuyên bố đạo đức

Phương pháp thử nghiệm tuân thủ nghiêm ngặt các hướng dẫn đánh giá đạo đức về phúc lợi động vật và các yêu cầu chung đối với các thí nghiệm trên động vật, Trung Quốc. Thí nghiệm hiện tại đã được phê duyệt bởi Ủy ban Đạo đức Động vật Thể chế của Đại học Hải dương Thượng Hải (ngày thành lập: 18 tháng 2 năm 2016) với giấy phép số 20171025 có hiệu lực đến ngày 31 tháng 12 năm 2020.

3. Kết quả

3.1. Xác nhận tác nhân gây bệnh

Không tìm thấy ký sinh trùng nào trong tôm thẻ chân trắng bị bệnh. Tất cả tôm thử nghiệm được cảm nhiễm với dịch lọc nội tạng không có vi khuẩn đều sống sót mà không có thay đổi rõ ràng nào (dữ liệu không được hiển thị). Điều này cho thấy bệnh không phải do ký sinh trùng hoặc vi rút gây ra. 5 chủng chiếm ưu thế (được đánh số từ WS01 đến WS05) đã được thu từ gan tụy của tôm bị bệnh, được xác định là thành viên của chi Bacillus Aeromonas dựa trên phân tích gen 16S rRNA (GenBank gia nhập số MN367958, MN371228, MN367959, MN367960, MN148709) (Hình S1 và Hình 1), và không có gen nào được phân lập từ cơ. Kết quả cảm nhiễm vi khuẩn ở tôm chỉ ra rằng chỉ có chủng phân lập (WS05) gây bệnh cho tôm thẻ chân trắng, cho thấy giá trị LD50 là 4,8 × 104 CFU/ mL (Hình 2). Ngược lại, không có thay đổi rõ ràng hoặc tôm chết ở đối chứng. Tôm nhiễm bệnh nhân tạo có dấu hiệu teo gan tụy tương tự như tôm nhiễm bệnh tự nhiên (Hình 3), và cùng một chủng (WS05) đã được phân lập lại từ tôm bị bệnh thực nghiệm và được xác nhận bằng nhận dạng kiểu hình và phân tử. Hơn nữa, những thay đổi mô bệnh học ở gan tụy từ tôm bị nhiễm bệnh tự nhiên và tôm bị nhiễm bệnh nhân tạo cho thấy sự sắp xếp rối loạn của các ống gan tụy và sự xâm nhập của tế bào viêm (Hình 4). Ngoài ra, một phân tích bằng kính hiển vi điện tử còn cho thấy tế bào gan tụy bị tổn thương ở cả tôm bị nhiễm bệnh tự nhiên và tôm bị nhiễm bệnh nhân tạo, bao gồm sự hình thành bất thường của myelin trong ty thể và giãn nở mạng lưới nội chất (Hình 5). Những phát hiện này đã chứng minh rằng phân lập WS05 là tác nhân gây bệnh này.

Hình 1. Cây phát sinh gen 16S rRNA của 40 loại vi khuẩn đã biết và phân lập WS05 được xây dựng bằng phương pháp cây ghép hàng xóm (neighbor-joining). Độ dài của các chuỗi được căn chỉnh là 1430 bp. Các giá trị bootstrap (%) được hiển thị bên cạnh các nhánh, các số gia nhập được chỉ định bên cạnh tên của các chủng và các thanh tỷ lệ biểu thị các giá trị khoảng cách.

Hình 2. Độc lực của WS05 phân lập ở mật độ tế bào cuối cùng là 2,0 × 103 đến 2,0 × 107 CFU/ mL đối với tôm thẻ chân trắng thử nghiệm. Ctrl, Nhóm đối chứng; T1, Xử lý bằng WS05 phân lập ở 2,0 × 107 CFU/ mL; T2, Xử lý bằng WS05 phân lập ở 2,0 × 106 CFU/ mL; T3, Xử lý bằng WS05 phân lập ở 2,0 × 105 CFU/ mL; T4, Xử lý bằng WS05 phân lập ở 2,0 × 104 CFU/ mL; T5, Xử lý bằng WS05 phân lập ở 2,0 × 103 CFU/ mL. Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD.

Hình 3. Dấu hiệu chung của tôm bị ảnh hưởng trong vùng bùng phát dịch bệnh. (a) Tôm bệnh. Mũi tên cho thấy gan tụy bị teo; (b) tôm khỏe mạnh. Mũi tên cho thấy gan tụy bình thường.

Hình 4. Những thay đổi mô bệnh học ở gan tụy bị teo của tôm bị ảnh hưởng. (a) Rối loạn sắp xếp các ống gan tụy (mũi tên đỏ) và thâm nhiễm tế bào viêm (mũi tên đen) trong gan tụy bị nhiễm bệnh tự nhiên; (b) rối loạn sắp xếp các ống gan tụy (mũi tên đỏ) và thâm nhiễm tế bào viêm (mũi tên đen) trong gan tụy bị nhiễm trùng nhân tạo; (c) sự sắp xếp bình thường của ống gan tụy (mũi tên đỏ) ở gan tụy khỏe mạnh.

Hình 5. Những thay đổi siêu cấu trúc trong gan tụy bị teo của tôm bị ảnh hưởng. (a) Sự hình thành  myelin của ty thể (mũi tên đỏ) và giãn mạng lưới nội chất (mũi tên trắng) trong tế bào chất của tế bào bị nhiễm bệnh tự nhiên (5000×); (b) thể myelin của ty thể (mũi tên đỏ), đang hình thành và mạng lưới nội chất giãn nở (mũi tên trắng) trong tế bào chất của tế bào bị nhiễm nhân tạo (5000×); (c) ty thể bình thường (mũi tên đỏ) và mạng lưới nội chất (mũi tên trắng) trong tế bào chất của tế bào khỏe mạnh (5000×).

3.2. Xác định chủng gây bệnh

Chủng WS05 được xác định về mặt kiểu hình và phân tử là A. hydrophila. Nó thể hiện các đặc điểm kiểu hình giống với các chủng tham chiếu của A. hydrophila. Chủng WS05 dương tính với việc sử dụng arginine, lysine, citrate và tryptophan và âm tính với sự phát triển của amygdalin, inositol, melibiose, rhamnose và sorbitol (Bảng 1). Hơn nữa, các trình tự gen 16S rRNA, gyrB, rpoB của chủng WS05 phân lập (số gia nhập GenBank MN148709, MN394631, MN394672 ) tương ứng cho thấy sự tương đồng 99% với các chủng A. hydrophila đã biết trong cơ sở dữ liệu của GenBank. Cây phát sinh gen được xây dựng bằng phương pháp neighbor-joining đã chứng minh chủng WS05 là một chủng A. hydrophila (Hình 1, Hình 6 và Hình 7), phù hợp với việc xác định kiểu hình của chủng WS05 (Bảng 1).

Hình 6. Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự gen gyrB của 39 chủng Aeromonas và phân lập WS05 được xây dựng bằng phương pháp neighbor-joining. Độ dài của các chuỗi được căn chỉnh là 765 bp. Các giá trị bootstrap (%) được hiển thị bên cạnh các nhánh, các số gia nhập được chỉ định bên cạnh tên của các chủng và các thanh tỷ lệ biểu thị các giá trị khoảng cách.

Hình 7. Cây phát sinh gen dựa trên trình tự gen rpoB của 32 chủng Aeromonas và phân lập WS05 được xây dựng bằng phương pháp neighbor-joining. Độ dài của các chuỗi được căn chỉnh là 423 bp. Các giá trị bootstrap (%) được hiển thị bên cạnh các nhánh, các số gia nhập được chỉ định bên cạnh tên của các chủng và các thanh tỷ lệ biểu thị các giá trị khoảng cách.

Bảng 1. Đặc điểm kiểu hình của phân lập WS05

3.3. Tính mẫn cảm với kháng sinh của chủng gây bệnh

Dữ liệu (Bảng S1) chỉ ra rằng chủng WS05 nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh thú y ngoại trừ novobiocin và rifampicin, bao gồm amoxicillin, cotrimoxazole, cefotaxime, doxycycline, enrofloxacin, florfenicol, gentamicin, kanamycin, axit nalidixic, neomycin, netilmicin, oxacillin, polymyxin B, streptomycin, tetracycline và tobramycin. Đặc biệt, chủng WS05 rõ ràng đã biểu hiện tính nhạy cảm với cotrimoxazole, doxycycline, florfenicol, neomycin và tetracycline, hiện đang được phép sử dụng trong nuôi trồng thủy sản.

3.4. Tác dụng hiệp đồng của chiết xuất thảo mộc Florfenicol

MIC của florfenicol và chiết xuất thảo mộc đơn lẻ hoặc kết hợp chống lại WS05 phân lập được trình bày trong Bảng 2. Kết quả chỉ ra rằng chỉ có sự kết hợp giữa chiết xuất florfenicol và P. granatum mới có tác dụng kháng khuẩn tổng hợp đối với chủng WS05. Khi kết hợp với 7,81 mg/ mL chiết xuất P. granatum, MIC của florfenicol chống lại chủng WS05 đã giảm từ 0,50 xuống 0,03 mg/ L. FICI cho sự kết hợp của chiết xuất florfenicol và P. granatum được tính là 0,31. Tuy nhiên, florfenicol thể hiện tác dụng phụ đối với chủng WS05 khi được kết hợp với các chất chiết xuất từ ​​A. argyi, A. capillaries, Galla chinensis, P. mume, Radix aucklandiae Radix sophorae flavescentis. Tác dụng chung của florfenicol với chiết xuất từ ​​các loại thảo mộc khác (C. segetum, F. toosendan, P. aviculare, Polygonum cuspidatum, Radix et rhizoma rhei, Radix scutellariae, Radix sanguisorbae, Radix bupleuri, Rhizoma acori tatarinowii) cho thấy không có tương tác. Điều này cho thấy chiết xuất P. granatum có thể được coi là một chất hiệp đồng tiềm năng của florfenicol chống lại chủng WS05.

Bảng 2. MIC của florfenicol và chiết xuất thảo mộc đơn lẻ hoặc kết hợp chống lại WS05 phân lập.

3.5. Thử nghiệm in vitro chiết xuất Florfenicol – granatum

Đường cong  chết phụ thuộc vào thời gian với chiết xuất florfenicol và P. granatum đơn lẻ hoặc kết hợp được trình bày trong Hình 8. Không quan sát thấy mật độ tế bào của chủng WS05 phân lập giảm trong nhóm đối chứng và việc xử lý đơn lẻ bằng florfenicol và chiết xuất P. granatum chỉ cho thấy hoạt tính kháng khuẩn nhẹ so với đối chứng. Ngược lại, sự kết hợp giữa chiết xuất florfenicol và P. granatum thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đáng kể chống lại chủng WS05, với mật độ tế bào giảm đáng kể ≥ 3,61 log sau 24 giờ điều trị so với điều trị bằng kháng sinh đơn lẻ (p < 0,05). Theo các tiêu chí được đề xuất bởi Pillai và cộng sự (2005) hiệp lực đó được định nghĩa là mức giảm tương ứng ≥ 2 log CFU/ mL về hoạt tính kháng khuẩn được tạo ra bởi sự kết hợp so với hoạt tính của tác nhân hoạt động mạnh hơn sau 24 giờ, hoạt tính kháng khuẩn trong ống nghiệm của sự kết hợp giữa florfenicol và chiết xuất P. granatum có thể được phân loại là tác dụng hiệp đồng, phù hợp với những phát hiện trong nghiên cứu nghiệm tác dụng hiệp đồng ở trên.

Hình 8. Đường cong chết phụ thuộc vào thời gian với 0,03 mg/ L florfenicol và 7,81 mg/ mL chiết xuất P. granatum đơn lẻ hoặc kết hợp chống lại WS05 phân lập.

3.6. Tác dụng bảo vệ của chiết xuất Florfenicol – granatum

Tác dụng bảo vệ của chiết xuất florfenicol và P. granatum đơn lẻ hoặc kết hợp được thể hiện trong Hình 9. Không quan sát thấy tỷ lệ chết ở tôm chân trắng thử nghiệm trong nhóm trống và nhóm đối chứng dương tính (dữ liệu không được hiển thị) và phương pháp xử lý đơn lẻ bằng florfenicol và chiết xuất P. granatum chỉ cho thấy tác dụng bảo vệ nhẹ so với đối chứng âm tính, chỉ với 13,34 % và giảm 16,67% tỷ lệ chết tích lũy của tôm so với đối chứng âm. Tuy nhiên, sự bảo vệ đáng kể đã được tạo ra bởi sự kết hợp giữa chiết xuất florfenicol và P. granatum, với tỷ lệ chết tích lũy là 36,66% (p <0,05) và 33,33% (p <0,05) thấp hơn so với điều trị đơn lẻ bằng florfenicol và chiết xuất P. granatum sau cảm nhiễm với WS05 cách ly trong 7 ngày. Tất cả tôm thử nghiệm chết là do các chủng cảm nhiễm gây ra, được xác định bằng cách phân lập và xác định vi khuẩn (dữ liệu không được hiển thị). Những phát hiện này chỉ ra rằng sự kết hợp giữa chiết xuất florfenicol và P. granatum có thể tăng cường tác dụng bảo vệ chống nhiễm trùng A. hydrophila ở tôm thẻ chân trắng nuôi nước ngọt.

Hình 9. Bảo vệ 0,03 mg/ L florfenicol và 7,81 mg/ mL chiết xuất P. granatum đơn lẻ hoặc kết hợp chống lại thách thức phân lập WS05 ở tôm thẻ chân trắng. Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD.

4. Thảo luận

Tác động của A. hydrophila trong nuôi trồng thủy sản đã được ghi nhận rõ ràng, với tỷ lệ chết hàng loạt được báo cáo ở tôm tiên Branchipus schaefferi (Fisher), tôm càng xanh Pacifastacus leniusculus, cá rô đồng Anabas testudineus, cá trắm cỏ Ctenopharynngodon idellus, cá chép bạc Hypophthalmichthys molitrix, cá da trơn phương nam Silurus meridionalis, cá tráp trắng Parabramis pekinensis, và cá tuyết Murray Maccullochella peelii. Tuy nhiên, có rất ít thông tin về nhiễm A. hydrophila ở tôm thẻ chân trắng nuôi nước ngọt. Do đó, cần chú ý nhiều hơn đến mầm bệnh tôm thẻ chân trắng A. hydrophila.

Nhiều yếu tố độc lực đã được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh của A. hydrophila, bao gồm Flagella, elastase, haemolysin, enterotoxin aerolysin. Các bệnh do A. hydrophila gây ra trong nuôi trồng thủy sản thường liên quan đến việc sản xuất các yếu tố độc hại này. Nói chung, các vi khuẩn phân lập được trong nuôi trồng thủy sản được phân loại là độc lực, độc lực yếu hoặc độc lực dựa trên liều lượng và thời gian sống sót sau cảm nhiễm. Độc lực Vibrio parahaemolyticus chủng VP1 được phân lập từ tôm He bị nhiễm vibrio ở Ấn Độ đã được báo cáo là làm chết 35% tôm sau 7 ngày cảm nhiễm bằng cách ngâm ở nồng độ cuối cùng là 2,1 × 104 đến 1,3 × 105 CFU/ mL. Dữ liệu chỉ ra rằng phân lập WS05 của A. hydrophila có thể gây ra tỷ lệ chết trung bình từ 40% đến 55% ở tôm khỏe mạnh sau 7 ngày cảm nhiễm ở 2,0 × 104 đến 2,0 × 105 CFU/ mL, với giá trị LD50 của 4,8 × 104 CFU/ mL. Điều này cho thấy A. hydrophila chủng WS05 độc hơn V. Parahaemolyticus VP1 và có thể gây ra mối đe dọa nghiêm trọng hơn đối với nghề nuôi tôm He. Ngoài độc lực của A. hydrophila phân lập WS05, có thể có các yếu tố thứ cấp khác gây ra bệnh này, cũng cần được nêu lên như những mối lo ngại, chẳng hạn như amoniac và sulfua, có thể làm tăng tính nhạy cảm của tôm chân trắng đối với nhiễm trùng do vi khuẩn do suy giảm khả năng miễn dịch.

Trong nhiều trường hợp, A. hydrophila thường được tìm thấy ở hệ động vật thủy sinh và thường kết hợp với giáp xác chân chèo, chúng có thể tiếp tục vận chuyển vi khuẩn này đến các vùng nuôi khác để dẫn đến bệnh aeromonasis. Do đó, A. hydrophila chủng WS05 có thể gây nguy hiểm cho nhiều động vật thủy sinh nhạy cảm với Aeromonas và không nên đánh giá thấp việc kiểm soát phân lập này. Một số nghiên cứu đã báo cáo rằng hơn 300 chủng A. hydrophila từ động vật thủy sinh đã thể hiện khả năng kháng rifampicin và novobiocin tương đối cao. Điều này cũng được quan sát thấy ở A. Hydrophila chủng WS05. Ngoài ra, dữ liệu chỉ ra rằng A. Hydrophila chủng WS05 nhạy cảm với cotrimoxazole, doxycycline, florfenicol, neomycin và tetracycline, có thể được sử dụng để điều trị bệnh này. Tuy nhiên, một trong những vấn đề quan trọng nhất liên quan đến việc điều trị bằng kháng sinh chống lại A. hydrophila trong nuôi trồng thủy sản là khả năng kháng kháng sinh dễ dàng phát triển. Do đó, cần có các kỹ thuật mới để ngăn chặn sự phát triển kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh để làm cho ngành nuôi trồng thủy sản bền vững hơn.

Tóm lại, nghiên cứu này lần đầu tiên xác định A. hydrophila là tác nhân gây bệnh cho tôm thẻ chân trắng và cho thấy chiết xuất P. granatum tăng cường tác dụng kháng khuẩn của florfenicol, gợi ý khả năng sử dụng loại thảo mộc này kết hợp với florfenicol để chống lại tôm gây bệnh A. hydrophila.

Theo Huihua Zhou, Chunlei Gai, Guifang Ye, Jian An, Kai Liu, La Xu, Haipeng Cao

Nguồn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6843590/

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hóa Bình Minh

Xem thêm: